博来霉素诱导肺纤维化动物模型

一、实验材料准备

1. 实验动物

   • 常用动物：C57BL/6小鼠（8-12周龄，雄性更常用，因雌性激素可能部分抗纤维化）。

   • 对照设置：需设生理盐水对照组（假手术组）。

   • 饲养条件：SPF级环境，避免感染干扰结果。

2. 试剂与设备

   • 博来霉素（BLM，如Sigma-Aldrich，常用盐酸盐形式）。

   • 生理盐水（用于溶解BLM）。

   • 麻醉剂（异氟烷或戊巴bi妥钠）。

   • 气管插管设备（如22G静脉导管或专用气管插管针）。

   • 小动物呼吸机（非必需，但可提高手术安全性）。

   • 无创血氧仪（监测术后缺氧情况）。

   • 组织固定液（如4%duo聚甲醛）。

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二、模型构建步骤

1. BLM溶液配制

• 浓度选择：

  • 小鼠：1–3 U/kg（常用2 U/kg，溶于50 μL生理盐水）。

  • 大鼠：5–7 U/kg（需调整体积）。

• 溶解方法：BLM用生理盐水现配现用，避免反复冻融（活性降低）。

2.给药方式

博来霉素可通过以下途径诱导肺纤维化，气管内滴注最常用：

（1）气管内滴注法（推荐）

1. 麻醉：异氟烷（4%诱导，1.5–2%维持）或戊巴bi妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠。

2. 固定：将小鼠仰卧位固定于倾斜板（头高脚低30°）。

3. 气管暴露：

   • 切开颈部皮肤，分离肌肉暴露气管。

   • 用细针（如27G）在气管环间穿刺，插入导管。

4. 滴注BLM：缓慢注入BLM溶液（50 μL），随后注入100 μL空气冲洗导管。

5. 缝合伤口：消毒后缝合皮肤，保持小鼠37℃复苏。

（2）经鼻滴注法（操作简单，但变异大）

• 麻醉小鼠后，用移液器将BLM溶液（2–3 U/kg，50 μL）滴入鼻腔，利用吸气动作吸入肺部。

（3）雾化吸入法（更接近临床，但设备要求高）

• 使用雾化器将BLM溶液雾化，小鼠置于密闭舱内吸入30–60分钟。

3.术后护理

• 单笼饲养，提供软食和温水。

• 监测体重（纤维化小鼠体重常下降10–20%）。

• 观察呼吸频率、拱背等痛苦表现，必要时镇痛（如布洛芬）。

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三、模型评估与验证

1.时间节点

• 急性炎症期：BLM给药后7–14天（以炎症细胞浸润为主）。

• 纤维化期：14–28天（胶原沉积，成纤维细胞活化）。

2.检测方法

（1）组织学分析（金标准）

• 取材：处死小鼠后，肺组织4%duo聚甲醛固定，石蜡包埋切片。

• 染色：

  • HE染色：观察炎症浸润和结构破坏。

  • Masson三色染色或天狼星红染色：定量胶原沉积（纤维化标志）。

• 评分标准：Ashcroft评分（半定量评估纤维化程度）。

（2）羟脯氨酸检测（胶原含量定量）

• 取肺组织水解后检测羟脯氨酸（胶原蛋白特征性氨基酸）。

（3）肺功能检测（可选）

• 使用小动物肺功能仪测量肺顺应性、阻力等（需专用设备）。

（4）分子标志物检测

• qPCR/Western Blot：检测纤维化相关基因（如TGF-β、α-SMA、Collagen I/III）。

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四、注意事项

1. 剂量优化

   • BLM剂量需预实验调整：

     • 过高剂量（＞3 U/kg小鼠）可能导致急性死亡。

     • 过低剂量（＜1 U/kg）可能无法诱导显著纤维化。

2. 动物品系差异

   • C57BL/6小鼠对BLM敏感，BALB/c小鼠抗性较强。

3. 对照组设置

   • 必须设生理盐水对照组（同体积滴注）。

4. 伦理与终点

   • 若小鼠出现严重呼吸困难或体重下降＞20%，需提前安le死。

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五、常见问题与解决

• 死亡率高：

  • 降低BLM剂量至1.5 U/kg。

  • 术后补充氧气（如氧舱放置1小时）。

• 纤维化不均匀：

  • 确保气管内滴注时BLM分布均匀（滴注后直立小鼠轻摇）。

• 炎症主导无纤维化：

  • 延长观察时间至28天（纤维化高峰）。