外泌体提取试剂盒（培养细胞上清、尿液或其他体液）

外泌体提取试剂盒(培养细胞上清、尿液或其他体液)产品描述

Cat NO: IME-I001

外泌体是细胞分泌的含有 RNA 和蛋白质的囊泡 (30~200 nm)，在体液中大量存在，包括血液、 唾液、尿液和母乳等。外泌体在细胞间充当信使，运送货物特异性使其具有不同的功能。然而，外泌 体的形成、货物的分选方式以及它们参与的生物途径仍未完全研究清楚。外泌体研究需要分离得到完 整的外泌体，当前超速离心是分离的金标准，但这需要昂贵的设备。

本试剂盒提供了一种分离纯化培养细胞上清、尿液或其他体液的外泌体的简单可靠的方法。通过 促进不易溶解的组分(即外泌体)从溶液中沉淀，操作简单，结果重复性好，杂蛋白含量少，只需普 通离心机就可以分离得到较纯的完整外泌体，可用于电镜粒径分析，RNA 和蛋白分析，以及细胞和动 物实验等。

外泌体提取试剂盒(培养细胞上清、尿液或其他体液)适用范围

本说明书适用于从细胞上清、尿液或其他体液中纯化外泌体，请严格参照说明书操作。本产品仅 用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途!

外泌体提取试剂盒(培养细胞上清、尿液或其他体液)运输和存储条件

(1)运输条件：常温运输，国内现货 2~3 天即可送达。

(2)储存条件：常温储存。

外泌体提取试剂盒(培养细胞上清、尿液或其他体液)产品组成信息

表 1. 试剂盒组成信息

产品货号	产品名称	产品规格	储存
IME-I001S	Exosome Concentration Solution	12 mL	常温，2年
	Exosome Purification Filter	2 Tubes
IME-I001M	Exosome Purification Filter	120 mL
	Exosome Concentration Solution	20 Tubes

自备材料

冷冻高速离心机，50 mL 离心管，1.5 mL 离心管，1 ×PBS 缓冲液(无菌)。

操作流程

样品预处理：

1 、如果是冻存于-80℃样品，取出于 4℃或冰上溶化，如果是新鲜样品，收集后置于冰上，建议单 次提取时的样品量不低于 20 mL。

2 、在 4℃ 3000g 离心 30min 去除细胞碎片或死细胞，若沉淀较多，重复该步骤一次。

3 、将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃以 10000g 离心 30 min ，以去除样品中的大囊泡， 处理后的上清液转移到新离心管中。

4 、(可选)如果有 0.22µm 过滤装置，可进行过滤处理以进一步去除如凋亡小体等大囊泡。

 外泌体提取：

1 、加 Exosome Concentration Solution(ECS)：在处理后的离心上清液中按 4 ：1 加入 ECS ，如 20mL 上清液加入 5 mL 的 ECS 。(注：使用前上下颠倒 5-6 次混匀。)

2 、通过涡旋震荡器混匀 1min 或上下倒置 10-12 次，直到溶液均匀。

3 、将样品在 4℃孵育 8h 以上(增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h)。

4、孵育后，将样品在 4℃以 10000g 离心 60min，移液吸出上清液并丢弃，尽量去除液体。(注： 如果使用的是定角转子，沉淀分布在离心管外侧整个侧面)。

5 、将试管在 4℃以 10000g 离心2min，弃去上清，至无任何残留液体。

6 、取适量 1 ×PBS 重悬外泌体(建议每 20 mL 上清用 100~200 μL 左右 1 ×PBS 重悬)。

7、将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中，于 4℃以 3000 g 离心 10 min(可适当延长离心时间)，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体 颗粒(注：EPF 柱不可重复使用)。

8 、纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

注意事项

(1)使用前请仔细阅读说明书，建议严格参照本说明书进行纯化外泌体操作。若需技术支持，欢 迎随时致电。

(2)操作过程中需使用无菌器材和试剂，避免外泌体样本被污染。

(3)孵育和离心步骤需在 4℃下进行，以保持外泌体的稳定性。

(4)提取的外泌体可重悬于 PBS 中，分装后于-80℃保存，避免反复冻融。

常见问题

(1)细胞培养时，如何去除培养基中牛血清来源的外泌体?

多数情况下，体外细胞培养时培养基中需要添加牛来源血清，但血清中含有大量外泌体，会污染 细胞分泌的外泌体，影响外泌体后续实验，可以采取以下三种方法操作：当细胞长到近乎单层，换成 无血清培养基，在 24~48 h 后收集细胞培养上清;将血清以 100000g 超速离心 10h 以上去除血清外泌 体，或者购买商业化的去除外泌体的血清;还可查询有无化学成分确定的，无血清培养基进行替换。

(2)提取的外泌体如何保存?

短时间内使用，可在 2~8℃短暂保存 1~2 天，若长时间保存，建议放在-80℃冰箱中，避免反复冻 融。此外，可使用商业化的外泌体储存试剂，进一步保护外泌体。

(3)重悬的外泌体颗粒不能通过或部分通过纯化柱，如何处理?

当提取的外泌体含有较多的污染蛋白质，离心经过纯化柱时可能会堵塞滤膜，因此，重悬时需要 多次吹打，彻底溶解沉淀，然后在经过纯化柱纯化。

(4)如何鉴定提取的外泌体?

一般确定外泌体一般需要三个条件：电镜形态观察，颗粒粒径测定和蛋白标志物检测(Western Blot 检测 CD9、CD63 以及 CD81 任意两个表达阳性;Alix、Tsg101 任意一个表达阳性;Calnexin、histone 3 以及 GM130 任意一个表达阴性)。