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文献和实验。 Western Blotting的protocol种类繁多,但大同小异,基本为上述几个步骤。要得到一个完美的实验结果,不仅需要优质的抗体,同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制,才能最终达到你的实验目的。 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性,只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体,所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的蛋白在免疫
一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1 .荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2 .在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白( BSA ),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞
是目前公认的研究此相互作用的最佳选择,是真核生物基因表达机制研究中不可或缺的核心技术之一。它的基本原理是在活细胞状态下,固定蛋白质-DNA(染色质)复合物,并将其切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法(抗体亲和)沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段,通过对目的片段的纯化与后期检测,从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。ChIP 不仅可以检测体内多种转录因子与 DNA 的动态作用,还可用来研究组蛋白的各种共价修饰(如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等)与不同状态
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