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20ul
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文献和实验2~4 h,使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连; 免疫沉淀反应后,在 4 ℃ 以 3 000 rpm 速度离心 3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗 3~4 次;最后加入 15 μl 的 2 × SDS 上样缓冲液,沸水煮 5 分钟; SDS-PAGE,Western blotting 或质谱仪分析。 四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜
被单克隆或多克隆抗体,这些抗体分别采用以下试剂作为稳定剂:Stabilguard biomolecule stabilizer (SurModics Inc.; Eden Prairie, MN)、 Stabilcoat immunoassay stabilizer (SurModics Inc.)、Superblock blocking buffer (Pierce Chemical Co.; Rockford, IL) 以及牛血清白蛋白 (BSA)。其中使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性
。 Western Blotting的protocol种类繁多,但大同小异,基本为上述几个步骤。要得到一个完美的实验结果,不仅需要优质的抗体,同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制,才能最终达到你的实验目的。 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性,只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体,所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的蛋白在免疫
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