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- 2025年07月13日
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免疫荧光四标五色扫描全套（切片）
服务介绍：
免疫荧光四标即利用酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技术，在同一张切片上对四种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。
TSA技术主要原理为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H2O2的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪-氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过微波处理，非共价结合的一抗二抗被打断并洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色
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名称 |
规格 |
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免疫荧光四标五色扫描全套（切片） （包含免疫荧光染色和扫描） |
张 |
送样运输要求：
1、石蜡切片常温保存运输，冰冻切片﹣20℃保存运输
2、细胞爬片PFA固定15min后用无菌PBS洗涤，无菌PBS浸泡，4℃冰袋保存运输到实验室
实验大体流程：
石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双-氧水封闭——血清封闭——孵育第一种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第二种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第三种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第四种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。
（TSA荧光染料的搭配及加样顺序根据各抗体的表达情况来确定。）
实验具体流程：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ PH 6.0 柠檬酸；PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒
中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定）。
3、画圈, 双-氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒滴加3%双-氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
7、加iF440-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF440-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
8、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
9、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
10、加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
11、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
12、加iF488-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF488-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
13、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
14、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
15、加第三种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
16、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
17、加iF555-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF546-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
18、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
19、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
20、加第四种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
21、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
22、加iF647-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF647-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
23、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
24、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
25、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
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文献和实验免疫荧光四标五色扫描全套（切片）
面图像。图中可以清楚地发现，在细胞顶部，其胞体面积及突起数量很少，然后依次增加；在细胞中间部位胞体面积和突起数量最多，而后又依次减少；细胞底部胞体面积明显减少，突起已经基本消失。同时，激光扫描共聚焦显微镜还可以利用免疫荧光组织化学以及原位杂交方法的双重或多重标记同时显示被检细胞亚细胞结构和靶分子(蛋白或基因等)与细胞或所在组织的关系。 神经元光学切片图 使用激光扫描共聚焦显微镜对经过荧光染色的神经元从细胞的顶部按照Z轴步距，逐层向细胞底部进行断层扫描，获得该神经元相应的光学横断面图像
光定量表达。 Ⅰ、Ⅲ型胶原以红、绿双色荧光通道扫描观察，绿色荧光的激发波长为488nm，在；30nm波长以上观察，红色荧光的激发波长为543nm，在；60nm波长以上观察。每张切片选取10个视野观察，并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与荧光面积。上述指标的荧光值＝平均荧光强度×平均荧光面积。研究结果显示：经FITC和TRITC免疫荧光双重染色的Ⅲ型胶原阳性表达为绿色荧光；I型胶原阳性表达为红色荧光。慢性肝炎、肝硬化患者Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达大量增加，在门管区、血管壁周围及炎性坏死区均可见到I、Ⅲ型胶原表达增加
Nature Cancer I 生物标志物多参数评估mTLS预测实体瘤免疫治疗效果
性，但得益于强大、稳定的 PhenoImager多重免疫荧光整体方案，这项研究可以实现多中心独立实验、大样本量染色、拍摄及分析实现标准化、可双盲评估微环境概况和 TLS 成熟度表征。进而得到新的发现 ，治疗前患者样本中存在成熟 TLS 可被视为患者对免疫治疗反应的预测指标，TLS 没有形成或未成熟组的肿瘤在反应率方面没有区别。mTLS 的预测价值可能不局限于特定肿瘤类型，在大多数肿瘤类型中都观察到具有良好预后的高相关性。 PhenoImager 解决方案，采用特色的 MOTiF™ 快速全组织片扫描
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