检测实验丨外泌体提取

外泌体（Exosome）提取

外泌体（Exosome）是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-150 nm，具有双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。

它们携带着多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，在细胞间通讯、疾病诊断与治疗中发挥着重要作用。由于外泌体在生物医学领域的潜在应用，其提取方法成为了研究热点。

一、原理

外泌体的提取主要基于其物理和化学特性，如大小、密度、表面标志物等。

常用的提取方法包括差速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀方法、分子排阻法等。这些方法通过不同的物理或化学手段，将外泌体从复杂的生物样本中分离出来。

二、实验步骤

1、预处理：

对于细胞培养上清，首先通过低速离心（如300g，4℃离心10min）去除死细胞和细胞碎片。对于血浆或尿液等生物体液，可能需要进行更复杂的预处理步骤，如去除血浆中的血小板、红细胞等。

2、差速离心：

①第一次离心：将预处理后的样本进行第一次离心，通常采用较低的离心力（2000g，4℃离心20min），以进一步去除较大的颗粒和杂质。小心收集离心后的上清液，避免吸到沉淀物。

②高速离心：将上清液转移到超速离心管中，进行高速离心（100,000g，4℃离心70min以上），使外泌体沉淀到管底。

3、洗涤与重悬：

离心结束后，小心去除上清液，留下沉淀物。用预冷的PBS缓冲液轻轻洗涤沉淀物，以去除残留的杂质。用适量的PBS缓冲液将洗涤后的沉淀物重悬，得到外泌体悬液。

4、存与检测：

将提取的外泌体悬液分装到无菌的EP管中，置于-80℃冰箱保存。同时，可以进行一系列的检测以验证外泌体的纯度和质量，如纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）观察、Western Blot检测外泌体标志蛋白等。

三、注意事项

1、操作温度：所有操作尽量在4℃条件下进行，以避免外泌体中内容物的降解和变性。

2、保护膜结构：操作中尽量减少外泌体的压力和剪切力，以保护其膜结构的完整性。