pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (Ra

产品简介：
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)的以用于生物素标记与RNA诱饵片段相互作用的目的蛋白的质粒。RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric)，利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记，后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图1)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence)：包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region)，与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。

图1. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图。

RaPID具有如下优点：①活细胞内标记：适合空间和时间上对细胞内RNA-蛋白质间的相互作用动态过程的研究，如亚细胞定位、翻译后修饰或蛋白质浓度变化导致的影响，还可以提供动力学数据。②不需要交联：RaPID无需交联，传统的甲醛或紫外光照射交联不仅对细胞影响较大，而且交联效率较低。③敏感性高：RaPID可以有效识别RNA与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。④所需细胞数目少：相比于常见的ChIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification)技术需要1-5×10⁸个细胞，RaPID只需要2-5×10⁶个细胞。⑤适用RNA种类多：对RNA结构没有限定，具有二级结构和无特定结构均可，而且可以研究<50nt的小RNA片段。⑥反应速度快：加入生物素后，miniTurbo最快10分钟就可以完成对RNA结合蛋白的生物素标记。

RaPID包括2个质粒：RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (本产品)，即RaPID protein；和RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)，即RNA component。

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)可在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)：λN肽段(MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN, 22aa)能够将miniTurbo定位结合到RNA诱饵片段旁的BoxB茎环结构上；核外运信号(Nuclear Export Signal, NES) 辅助miniTurbo进入细胞质中；miniTurbo是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶(BirA)人工改造获得的新型生物素连接酶，在ATP存在的条件下，miniTurbo可以高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记，从而对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记。

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (D3040)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体，RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间，其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。

本质粒含有CMV启动子，可以高效启动λN-NES-miniTurbo-Flag在细胞中的表达；表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	235-818
λN peptide	907-972
linker	973-1005
NES,Nuclear Export Signal	1015-1041
miniTurbo	1048-1818
3X Flag Tag	1825-1890
BGH poly(A) signal	1925-2149
f1 ori	2195-2623
SV40 promoter	2637-2966
Neomycin resistance gene	3033-3827
SV40 poly(A) signal	4001-4122
lac operator	4195-4211
CAP binding site	4264-4285
ori	4573-5158
Ampicillin resistance gene	5329-6189
Ampicillin promoter	6190-6294

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag质粒(6325bp)的图谱如下：

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag表达基因的详细图谱见说明书

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	Acc65I	AcvI	AfeI	AflII
AgeI	AjuI	AleI	Aor13HI	Aor51HI	AscI	AsiGI
AsiSI	Asp718I	AxyI	BaeI	BarI	BbrPI	BfrI
BlpI	BoxI	Bpu1102I	Bse21I	BseAI	BsgI	BshTI
BsiWI	BsmBI	Bsp13I	Bsp1407I	Bsp1720I	BspEI	BspTI
BsrGI	Bst98I	BstAFI	BstAUI	BstEII	BstHPI	BstPI
BstPAI	Bsu36I	CelII	Cfr42I	CspAI	Eco32I	Eco47III
Eco72I	Eco81I	Eco91I	EcoO65I	EcoRI	EcoRV	Esp3I
FseI	FspAI	HindIII	HpaI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI
KflI	KpnI	Kpn2I	KspI	KspAI	MauBI	MreI
MroI	MspCI	OliI	PacI	PaeR7I	PalAI	PaqCI
Pfl23II	PI-PspI	PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmlI	PpuMI
PshAI	Psp5II	PspCI	PspEI	PspLI	PspPPI	PspXI
PsrI	RgaI	RigI	SacII	SanDI	SfaAI	SfiI
Sfr274I	Sfr303I	SgfI	SgrBI	SgsI	SlaI	SmiI
SrfI	SspBI	SstII	SwaI	TstI	Vha464I	XbaI
XhoI

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag中的单酶切位点包括：

AhdI	AvaI	AvrII	BamHI	BbsI	BbvCI	BglII
BmeT110I	BmgBI	BmtI	BsmI	BsoBI	BspDI	BssHII
BstBI	BstXI	BstZ17I	ClaI	CsiI	DraIII	Eco53kI
EcoNI	MfeI	MluI	NdeI	NheI	NotI	NruI
PasI	PciI	PflFI	PflMI	PfoI	PmeI	PvuI
RsrII	SacI	ScaI	SexAI	SgrAI	SgrDI	SmaI
SnaBI	SpeI	SspI	TspMI	Tth111I	XmaI

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (1936-1919): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag的全序列信息:D3039 pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒).txt。

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。