pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (

产品简介：
pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体，RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间，其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。

RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric)，利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记，后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图1)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence)：包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region)，与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。

图1. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图。

RaPID具有如下优点：①活细胞内标记：适合空间和时间上对细胞内RNA-蛋白质间的相互作用动态过程的研究，如亚细胞定位、翻译后修饰或蛋白质浓度变化导致的影响，还可以提供动力学数据。②不需要交联：RaPID无需交联，传统的甲醛或紫外光照射交联不仅对细胞影响较大，而且交联效率较低。③敏感性高：RaPID可以有效识别RNA与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。④所需细胞数目少：相比于常见的ChIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification)技术需要1-5×10⁸个细胞，RaPID只需要2-5×10⁶个细胞。⑤适用RNA种类多：对RNA结构没有限定，具有二级结构和无特定结构均可，而且可以研究<50nt的小RNA片段。⑥反应速度快：加入生物素后，miniTurbo最快10分钟就可以完成对RNA结合蛋白的生物素标记。

RaPID包括2个质粒：RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (本产品)，即RNA component；和RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (D3039)，即RaPID protein。

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (D3039)可在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)：λN肽段(MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN, 22aa)能够将miniTurbo定位结合到RNA诱饵片段旁的BoxB茎环结构上；核外运信号(Nuclear Export Signal, NES) 辅助miniTurbo进入细胞质中；miniTurbo是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E. coli 生物素连接酶(BirA)人工改造获得的新型生物素连接酶，在ATP存在的条件下，miniTurbo可以高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记，从而对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记。

本质粒含有CMV启动子，可以高效启动RNA诱饵片段在细胞中的表达；可通过荧光显微镜观察细胞表达EGFP绿色荧光的情况，以确定在EGFP的3' UTR端诱饵RNA诱饵片段的表达情况；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	235-818
EGFP	907-1626
3X λ boxB right	1648-1706
Bait RNA insert site	1720-2114
3X λ boxB right	2129-2187
BGH poly(A) signal	2248-2472
f1 ori	2518-2946
SV40 promoter	2960-3289
Neomycin resistance gene	3356-4150
SV40 poly(A) signal	4324-4445
lac operator	4518-4534
CAP binding site	4587-4608
ori	4896-5481
Ampicillin resistance gene	5652-6512
Ampicillin promoter	6513-6617

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB质粒(6648bp)的图谱如下：

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB表达基因的详细图谱见说明书

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	Acc65I	AccB7I	AcvI	AfeI
AflII	AgeI	AjiI	AjuI	Aor13HI	Aor51HI	AscI
AsiGI	AsiSI	Asp718I	AxyI	BamHI	BanIII	BarI
BbrPI	BbvCI	BfrI	BlpI	BmgBI	BoxI	Bpu1102I
Bsa29I	Bse21I	BseAI	BseCI	BshVI	BshTI	BsiWI
Bsp13I	Bsp1720I	BspDI	BspEI	BspTI	BspXI	Bst98I
BstAFI	BstEII	BstHPI	BstPI	BstPAI	BstXI	Bsu15I
Bsu36I	BsuTUI	BtrI	CciNI	CelII	Cfr42I	ClaI
CspAI	DraII	Eco32I	Eco47III	Eco72I	Eco81I	Eco91I
EcoO65I	EcoO109I	EcoRV	FseI	FspAI	HpaI	I-CeuI
I-PpoI	I-SceI	KflI	KpnI	Kpn2I	KspI	KspAI
MauBI	MreI	MroI	MspCI	Nb.BbvCI	NotI	Nt.BbvCI
PacI	PalAI	PaqCI	PasI	Pfl23II	PflMI	PI-PspI
PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmlI	PpuMI	PshAI	Psp5II
PspCI	PspEI	PspLI	PspPPI	PspXI	PsrI	RgaI
RigI	SacII	SanDI	SbfI	SdaI	SfaAI	SfiI
Sfr303I	SgfI	SgrAI	SgrBI	SgsI	SmiI	SrfI
Sse8387I	SstII	SwaI	TstI	Van91I	Vha464I	XbaI
XcmI

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB中的单酶切位点包括：

AhdI	ApaI	AvrII	BbsI	BglII	BmtI	BsaBI
BsmI	BsrGI	BssHII	BstBI	BstZ17I	CsiI	DraIII
EagI	Eco53kI	KasI	MfeI	MluI	MscI	NarI
NdeI	NheI	NruI	PaeR7I	PciI	PflFI	PluTI
PmeI	PspOMI	PstI	PvuI	RsrII	SacI	ScaI
SexAI	SfoI	SgrDI	SmaI	SnaBI	SpeI	StuI
TspMI	Tth111I	XhoI	XmaI

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (2259-2242): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB的全序列信息:D3040 pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒).txt。

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。