pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg

产品简介：
pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和潮霉素B (Hygromycin B)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达，同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry，便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用Hygromycin B (ST1389)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
AmpR	63-923
AmpR promoter	924-1016
CMV enhancer	1101-1404
CMV promoter	1405-1608
T3 promoter	1654-1672
P2A	1769-1834
mCherry	1835-2542
FLAG	2549-2572
T7 promoter	2627-2645
SV40 poly(A) signal	2919-3040
f1 ori	3047-3502
AmpR promoter	3529-3633
SV40 promoter	3635-3992
SV40 ori	3843-3978
HygR	4027-5052
HSV TK poly(A) signal	5284-5331
ori	5660-6248

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg质粒(6356bp)的图谱如下：

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg的多克隆位点的详细图谱见说明书

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AcvI	AfeI	AflII	AgeI	AhlI
Aor51HI	AscI	AsiGI	BaeI	BbrPI	BcuI	BfrI
BlpI	Bpu1102I	BsePI	BshTI	BsiWI	Bsp68I	Bsp1720I
BspQI	BspTI	BssHII	BssNAI	Bst98I	Bst1107I	BstAFI
BstENI	BstZ17I	BtuMI	CelII	CspAI	Eco47III	Eco72I
EcoNI	FseI	FspAI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI	LguI
MauBI	MreI	MspCI	MssI	NruI	PalAI	PauI
PciSI	Pfl23II	PI-PspI	PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmeI
PmlI	PpuMI	Psp5II	PspCI	PspLI	PspPPI	PspXI
PsrI	RigI	SanDI	SapI	SgrDI	SgsI	SmiI
SpeI	SwaI	Vha464I	XagI

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg中的单酶切位点包括：

AccI	GT`MK,AC	1752	MluI	A`CGCG,T	3041
ApaI	G,GGCC`C	2580	MscI	TGG|CCA	1865
AsiSI	GCG,AT`CGC	4391	NdeI	CA`TA,TG	1274
BamHI	G`GATC,C	1721	NheI	G`CTAG,C	1631
BbsI	GAAGACNN`NNNN,	2270	NotI	GC`GGCC,GC	1702
BbvCI	CC`TCA,GC	2373	PaeR7I	C`TCGA,G	1763
BcgI	,NN`(N)10CGANNNNNNTGC(N)10,NN`	641	PciI	A`CATG,T	6304
BclI	T`GATC,A	2812	PflFI	GACN`N,NGTC	4531
BglII	A`GATC,T	1757	PflMI	CCAN,NNN`NTGG	2274
BmgBI	CAC|GTC	1813	PshAI	GACNN|NNGTC	4054
BmtI	G,CTAG`C	1635	PspOMI	G`GGCC,C	2576
Bpu10I	CC`TNA,GC	2373	RsrII	CG`GWC,CG	4435
BsgI	GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN`	2429	SacI	G,AGCT`C	1689
BsmBI	CGTCTCN`NNNN,	1803	SacII	CC,GC`GG	1696
BspDI	AT`CG,AT	3995	SalI	G`TCGA,C	1751
BsrGI	T`GTAC,A	2535	SbfI	CC,TGCA`GG	2190
BstBI	TT`CG,AA	5068	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	3930
BstXI	CCAN,NNNN`NTGG	1697	SgrAI	CR`CCGG,YG	2516
ClaI	AT`CG,AT	3995	SmaI	CCC|GGG	1716
CspCI	,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN`	1416	SnaBI	TAC|GTA	1380
EarI	CTCTTCN`NNN,	931	SrfI	GCCC|GGGC	1716
Eco53kI	GAG|CTC	1687	TspMI	C`CCGG,G	1714
EcoRI	G`AATT,C	1739	Tth111I	GACN`N,NGTC	4531
EcoRV	GAT|ATC	1747	XbaI	T`CTAG,A	2543
Esp3I	CGTCTCN`NNNN,	1803	XcmI	CCANNNN,N`NNNNTGG	2521
HindIII	A`AGCT,T	1727	XhoI	C`TCGA,G	1763
HpaI	GTT|AAC	2918	XmaI	C`CCGG,G	1714
MfeI	C`AATT,G	2905	XmnI	GAANN|NNTTC	735

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg质粒中对插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下：

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1837-1853): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg的全序列信息:D2798 pCMV-MCS-P2A-mCherry-Flag-Hyg.txt。

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。