细胞自噬检测

 

自噬过程:

■ 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore,是自噬发生的铁证之一。

 

■ 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有两个特征:一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

 

■ 步骤3：自噬体形成后，可与细胞溶酶体发生融合(这种情况不是必然要发生的)

 

■ 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

 

自噬核心调控基因为：

▶正向：LC3、ATG5、ATG7、Beclin 1、Other ATG family proteins。

▶负向：无。

释放损伤相关分子：HMGB-1。

免疫特征：抗炎为主。

 

一、自噬的检测

1.透射电镜检测:

1）Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。

2）自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。

3）自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜，胞浆成分已降解。

 

         ▲自噬透射电镜图

 

2.WB检测标志物LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、 Atg5、Atg14和Beclin-1；

 

            ▲ WB检测自噬标志物图

 

3.利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低；

        ▲WB检测自噬LC3比值变化

 

4.利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系；

5.mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统检测；

mRFP-GFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

        ▲LC3自噬双标系统追踪自噬流不同阶段

▲mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统检测感染细胞效果图

 

二、自噬相关检测&产品