Seebio® KAPA HiFi高保真酶

【求助】4 kb片段连接pcDNA3.1+的问题

含有这两种酶切位点序列。 已经开始进行ta克隆 如楼上战友所述，TA克隆的确是长片段亚克隆的好的手段。我最初开始学习构建质粒的时候也是先上TA，不过我们实验室一直使用一种KAPA HIFI readymix的酶，效果很好，保真性也非常非常高，就是做TA的时候比较麻烦，需要把PCR产物纯化回收后再加一次A tail，而就是这一步我感觉一直没有摸索到最优化稳定的条件，所以每次加A后连pCR2.1 转化的结果都不稳定，有时候长的多有时候长得少，之前曾经就这个问题发帖

【求助】质粒构建不成功，课题无进展，请求帮助

还是老板亲自动手演示了一遍，学到正宗的克隆技术，才得以成功。关于你的这个克隆，我的意见如下： 1）选用好一点的聚合酶，保证序列的保真性。我们一直使用一种叫做KAPA HIFI READYMIX的酶，很方便，扩增能力和保真度都超级好。普通的taq酶扩增长片段容易出错，反而浪费时间和试剂。 2） 如果直接酶切PCR产物，请确保你的上下游引物5'端已经引入合适的酶切位点和保护碱基（非常重要），我当时选用的是XhoI和HindIII这两个位点。 3）凡是用来做克隆的DNA产物，跑胶一定

四步致胜奇招 高效克隆你值得拥有（下篇）

飞的 GeneArt™ Gibson Assembly® 克隆试剂盒系列为例，Gibson Assembly 实际上是生命科学狂人文特尔（就是那个敢单挑 6 国合力的国际人类基因组计划还占尽上风，逼得当时美国总统出面协调让双方合作并同时发表结果的）东山再起后成立的 Venter 研究所旗下 Gibson 博士开发的，里面包含了精心优化搭配的三种酶活性：外切酶会外切双链末端而产生单链 3’突出端，使得外源片段和线性化载体的互补末端能够退火，聚合酶活性会填补退火片段产生的缺口，连接酶活性能够在重组后进行连接。得到