柱式真菌 RNAOUT

中文名称：柱式真菌 RNAOUT
英文名称：Column Fungal RNAOUT 
产品及特点：本产品是在本公司真菌 RNAout基础上改进的 柱式产品，跟真菌 RNAout 相比，它具有下列特点：
1. 柱式操作，更加简单快捷，整个过程只需要约 30 分钟。
2. RNA 纯度高，OD260/280 一般都在 2.0 左右，可直接用于 RT-PCR、 Norther 杂交、microarray hybridization、cDNA 合成等。
3. RNA 产量高，一般在 20-70 ug/mL 酵母培养物(约 2.0 ×107个细胞)。
4. 非酶细胞破裂法，适用于各种形态和各个种属的真菌及革兰氏阳性 细菌，包括 Candida albican、Saccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomycespombe、Pichiapastoris、Bacillus subtilis、Staphylococcusaureus 等。
规格及成分：

成 分	50 次包装
溶液 A	20 mL
溶液 B	25 mL
溶液 C	75 mL
溶液 D	25 mL
离心吸附柱	50 套
通用洗柱液	50 mL
RNA 洗脱液	10 mL
使用手册	1 份

运输及保存：常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：氯仿。
使用方法：
1.将 50 mg 左右的干菌丝(或 100 mg 左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌 菌落)转移到 1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将 1-10 mL 液体真菌在 1.5 mL 塑料离心管中 12000-15000 g 离心 1 分 钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。
2. 加入 0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混匀。如果 A 溶液存放时产生沉淀，请 置于 65℃融化，用前充分摇晃均匀。
3. 加入 0.4 mL 溶液 B，剧烈振荡 30 秒。
4. 65℃保温 5 分钟。
5. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑 料离心管中。
6. 再加入 0.1 mL 溶液 B 和 0.1 mL 自备氯仿，振荡混匀 30 秒。
7. 室温12000-15000 g离心3-5分钟，转移上清到一自备的、干净的5 mL 塑料离心管中。
8.加入相当于上清 3 倍体积的溶液 C（约 1.2-1.5 mL）和 1 倍体积的溶 液 D（约 0.4-0.5 mL），充分混匀。
9. 将 混合 液（约 2.5mL）分 3-4 次转 移 到 离心 吸 附 柱 中。 每次 13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
10. 用 0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中 的穿透液。
11. 一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品 OD260/280 比值不高，可以 再用 0.5 mL 通用洗柱液重复此步一次。
12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的洗柱液会影响 RNA 的使用。
13. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 1.5 mL 塑料离心管中，加入 30-100 uL RNA 洗脱液。
14. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于 -80℃待用。
15. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电 泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28： 414，2000）。如果是简单检测，可以使用 TAE 或 SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性 上样液（BioTechniques，9:558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性 剂，也没经过去 RNase 处理，所以最好不要使用。 尤其需要注意的是不 要使用 TBE 进行 RNA 电泳，因为 TBE 所含硼酸 是研究多糖的经典方 法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与 RNA 核糖中的羟基发生络 合反应，形成 RNA 分子内或 RNA 分子间的络合复 合物，使同样长度的 RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有 大的 RNA 络合复合 物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组 DNA 污 染）。RNA 分子内或 RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸 与 RNA 的数量比例 有关，而 RNA 样品中污染的其他多糖也会参与此反 应，使硼酸对 RNA 电泳的影响更复杂，所以 TBE 对 RNA 电泳的影响 没有规律性和重复性。 有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。
16. RNA 产量产率测定： 将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/细 菌用量)。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280， 否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%。
17. RNA 纯度测定： 无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与 其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230 一般在 2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或 多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/ 氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用DNA Erasol 和 PS Erasol 去除。测 OD 时 RNA 不能过度稀释 使 OD 读数低于仪器的有效范围。