流式周期

 

流式周期原理

流式周期原理主要应用于细胞周期分析其基本步骤和应用原理如下：

1. 样品制备：待测样品（如细胞、微球、精子或细菌等）被制成单细胞悬液，并放入样品管中。
2. 鞘液包裹：在一定的压力下，样品被鞘液包裹，形成单列的细胞。
3. 流动室检测：细胞在鞘液的约束下，通过流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，与激光束相交。
4. 光电转换：激光激发细胞后，产生散射光和荧光，这些光信号经过光电转换器处理，转换为电信号。
5. 数字显示：电信号在电脑上以数字信号的形式展现出来，用于分析和计算细胞周期各个阶段的DNA分布状态。

其中，PI法是一种经典的细胞周期检测方法。PI（插入性核酸荧光染料）能够选择性地嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间，与之结合的量与DNA的含量成正比关系。通过流式细胞仪分析，可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。例如，G0/G1期细胞的荧光强度为1，G2/M期细胞含有双份基因组DNA，其荧光强度的理论值为2。正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度介于1-2之间。

步骤 流式细胞仪检测细胞周期的步骤通常包括以下几个主要环节：

1. 细胞培养。取对数生长期的细胞，按照特定浓度接种于培养板中，并进行必要的处理，如加入药物。
2. 细胞固定。在特定时间后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤，然后加入预冷的75%乙醇进行固定，固定时间通常在4℃下超过4小时。
3. 细胞染色。将固定好的细胞用特定的染色剂如溴化乙锭（PI）和RNase A处理，这些染色剂可以与细胞内的DNA结合，同时使细胞核变成可检测的状态。
4. 流式分析。使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测，一般分析2到3万个细胞。检测时，细胞被高速离心并通过激光照射，细胞内的荧光染料与DNA结合后激发产生荧光信号，这些信号被转换成电信号并由计算机分析。
5. 数据处理与分析。使用特定的软件如ModFit或FlowJo对检测结果进行分析，这些软件能够根据细胞内DNA的含量和分布来拟合细胞周期各阶段的比例。

这些步骤的目的是检测和分析细胞在细胞周期中的分布，特别是细胞DNA的含量，从而了解细胞增殖和分化的状态。

 流式利用不同荧光物质标记的单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物发出的信号，利用这些信号，可计算出相对含量，从而得到细胞群的相对比值。

   细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能（G0期）。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量（2N），而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期。