LentiCRISPR v3-TRPV6-sgRNA1-Bl

CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计好之后

的表达质粒。A）PCR 扩增的方法U6：来源于人 U6 小核启动子，常用小 RNA 表达，转录本为 shRNA。将 sgRNA 放到 U6 后面，利用 U6 的启动来扩增 sgRNA。将这部分内容整合到 Cas9 expression plasmid pSpCas9（Cas9 表达质粒）中，一起共转。B）sgRNA 表达质粒的方法现在我要用这个方法来举例设计 p53 引物找到包括 sgRNA 序列的前后 1000 个碱基的序列（2000 bp）找到的序列如下：将上面复制的序列粘贴到 blast 中

CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导

gRNA 的设计，常用方法汇总解析》确定靶基因的序列，可通过在线网站设计 (http://tools.genome-engineering.org )，或根据靶基因的 CDS 序列自行设计，最方便的是在 human KO Library sgRNA 里选择。无论选择哪种方式，都建议进行一下 blast。附上在线设计网页截图。输入基因的 name，填写 email address，设计结果稍后会发送到此邮箱，选择序列的类型以及物种。如 sequence type 选择 unique region，一次

手把手教你学会 CRISPR Cas9 基因敲除技术

上有较大差异，因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。N1-N20 NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 BLAST 检测。Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。二、   插入