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pBM40 Toposmart
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产品介绍:利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM40哺乳动物表达载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。引物CMVforward和SV40PolyArev可用于菌落PCR和测序鉴定。产品特点:(1)连接反应仅需 5 分钟。(2)只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。(3)载体采用了新的制备工艺,零背景,无需蓝白斑筛选。(4)具有 CMV 启动子,适用于外源基因在哺乳动物细胞中的表达,带新霉素抗性基因,便于稳转细胞株的筛选。C 端带 FLAG 标签序列便于表达的目的蛋白质的检测。(5)相对于 pcDNA3.1 等其它哺乳动物表达载体,pBM40载体具有更小的质粒骨架,转染效率高。(6)载体具有卡那霉素和新霉素抗性。注意事项:(1)引物要求:PCR 引物 5’端不能进行磷酸修饰,普通商业化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四个碱基(CACC 为真核表达所必需的 Kozak 序列)。如果目的蛋白需要在 C 端带 FLAG 标签,下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子(3 个碱基),目的蛋白的翻译终止由 FLAG 标签的终止密码子 TAA(位于 Xho I 酶切位点前)来实现。(2)DNA 聚合酶:选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。(3)连接时间:5-15 分钟,通常用 15 分钟。(4)连接温度:室温 (22℃-30℃),可使用 PCR 仪控温。最佳反应温度为 25℃。若片段存在高 GC 等复杂结构,可在 37℃反应。PCR反应基本步骤:一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:变性(Denaturation):利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。退火或称接合,复性(Annealling):在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。延伸(Extension):DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。PCR 反应需要使用哪些试剂?一、模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;二、引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;三、dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;四、Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;五、PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;六、酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。七、MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。八、DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物; 公司供应的相关产品:
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