一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（绿色，FITC）

产品简介
Elabscience® One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit 是一款灵 敏度高且能快速简便的检测细胞凋亡的产品。本试剂盒适用于组织样本(石蜡切片、冰冻切片)和细胞样本(细胞涂片、细 胞爬片)的原位凋亡检测，检测结果可通过荧光显微镜直接观察。

检测原理
细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。使得凋亡细胞的DNA被切割成180~200bp片段，在琼脂糖凝胶上通常以180~200bp的阶梯状迁移。TdT酶（脱氧核糖核酸末端转移酶）将标记的dUTP连接到断裂DNA暴露的3'-OH末端，通过在这些末端添加荧光dUTP的方式来标记晚期凋亡细胞，从而可以通过荧光显微镜进行检测。

产品参数

试剂配制
1) 1×蛋白酶 K 工作液：取 1 μL Proteinase K (100×) 加入 99 μLPBS 中，混匀。现用现配。
2) 1×DNase I Buffer 工作液：按照 9:1 的比例用 ddH2O 将 DNase I Buffer (10×) 稀释待用。现配现用。
3) DNase I 工作液（200 U/mL）：用 1×DNase I Buffer 工作 液，按照 99：1 稀释比将 DNase I (20 U/μL) 稀释待用。 现配现用。
注：DNase I 会在剧烈混合下变性，建议不要涡旋 DNase I 溶液。
4) DAPI 工作液：取 4 μL DAPI Reagent(25 μg/mL) 加入 96 μL PBS 中混匀。现配现用。
固定与通透
1. 细胞样本
1) 细胞爬片：将细胞爬片浸入 PBS 漂洗 1 次，滤纸吸干周 围水分，再浸入固定液（自备），室温固定 15~20 min 或 4°C 固定 1~2 h。
细胞涂片：收集细胞，加入一定体积的 PBS 重悬细胞沉 淀，然后加入和 PBS 等体积的固定液（自备），室温固 定 15~20 min 或 4°C 固定 1~2 h。600×g 离心 5 min，PBS 重悬，取 25~50 μL 细胞悬液涂片在载玻片上晾干。 注：细胞固定是分析凋亡样本的重要步骤。未固定的细 胞可能会丢失较小的 DNA 片段，导致较低的信号。
2) 固定好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
3) 将样本浸入通透液（自备）中，37°C 作用 10 min。
4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
2. 石蜡切片
1) 用常规方法将切片脱蜡水化。将切片浸入二甲苯（自备） 脱蜡 2 次，每次 10 min；无水乙醇（自备）浸泡切片 2 次，每次 5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自备） 各一次，每次 3 min。
注：低温可能影响二甲苯脱蜡效果。当室温低于 20°C 时，二甲苯脱蜡时间可延长至 20 min。
2) 脱蜡好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
3) 滤纸吸干切片组织周围的水分，每个样本上滴加 100 μL 1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反应 20 min。
注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进 行预实验，确定反应时间。
4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
3. 冰冻切片
1) 取出冰冻切片，平衡至室温，再浸入固定液（自备）， 室温（15~25°C）固定 30 min。
2) 固定好的样本浸入 PBS 漂洗 2 次，每次 5 min。
3) 每个样本上滴加 100 μL 1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反应 10~20 min。
注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进 行预实验，确定反应时间。
4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
标记
1. 分组设置

注：阴性对照和阳性对照的制备可以同时进行。

 阳性对照
1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer 工作液到已通透的样本上, 室温平衡 5 min。
2) 用吸水纸去除样本上多余的液体。加入 100 μL 稀释后的 DNase I 工作液（200 U/mL)，37°C 孵育 10~30 min。
3) 样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
阴性对照
1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer 工作液到已通透的样本上, 室温平衡 5 min。
2) DNase I Buffer 孵育阴性样本，37°C 孵育 10~30 min。
3) 样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
实验组
1） 实验组通透完成后在 PBS 中静置，等待阳性对照和阴性 对照处理后共同进行标记染色。
2. 标记工作液的配制
计算好样本量集中配置，每个样本用量按照下表配制，充 分混匀，现用现配。

注： 1. TdT Equilibration Buffer 使用前，室温静置直至完全溶解。 冰冻的平衡液融化后可能会出现钴盐结晶，此为正常现 象，可在使用前涡旋混匀。
2. Labeling Solution 使用前，请置于冰上溶解，待完全溶解 后离心，并用枪头吹打混匀。
3. TdT Enzyme 对温度较敏感，请严格保存于-20°C，使用 前取出，使用后立即放回。
4. 配制标记工作液时，建议不要涡旋。
5. 50 μL 标记工作液可覆盖的样本面积约为 5 cm2，对于表 面积更大的样本可以成比例的增加工作液体积。
3. 标记步骤
1) 每个样本滴加 100 μL TdT Equilibration Buffer ，37°C 湿 盒中平衡 10~30 min。
2) 吸水纸吸除 TdT Equilibration Buffer（注意不要干片）。每 个样本滴加 50 μL 标记工作液，放入湿盒中 37°C 避光反 应 60 min。
注：如果信号强度较弱，则可延长 DNA 标记反应的培养 时间。某些系统可能需要在 37°C 下反应 4 小时。
3) 样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
4) 吸水纸吸干水分后滴加 DAPI 工作液，室温避光孵育 5 min，对细胞核进行复染。
5) 样本浸入 PBS 漂洗 4 次，每次 5 min。
6) 用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂（自备） 的封片剂封片。
检测

在荧光显微镜下选择合适的滤光片观察结果。

注：荧光易淬灭，请尽快观察拍照。若无法立即观察，请于 4°C 避光保存。

注意事项
1. 本产品仅限于专业人员的科学研究使用。
2. 请注意安全事项，遵守实验室试剂操作规范操作。
3. 洗涤过程应充分洗涤，否则会影响后续实验中酶的活性 （如 DNase I 和 TdT 酶）。用 PBS 清洗样本后，请用吸 水纸吸干样本周围的液体。
4. 实验过程中请保持样本的湿润，防止干片造成的实验失 败。
5. 荧光标记液和 TdT 酶避免反复冻融，建议不要涡旋。
6. 本说明书中推荐的条件是通用的，用户可根据不同的样本类型和预实验的结果，对样本处理时间、试剂浓度等 条件进行优化，选择最合适的实验条件。