毕赤酵母残留DNA（qPCR）检测试剂盒

        毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与 E.coli 及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物细胞培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍，这使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
        中国药典 2020 版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂 DNA 残留量不能超过 100 pg/剂，以细菌或真菌基质（酵母、大肠杆菌等）表达的生物制品中 DNA 残留量不超过 10 ng/剂。
        试剂盒可与abs60544宿主细胞残留 DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒配套使用。（宿主细胞残留 DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒配套使用时，提取时勿加酵母 tRNA。）
       建议所有使用该试剂盒的实验室按需可做以下验证：标准品线性、 样本线性、 准确度（加标回收率）、定量限、精密度(重复性)、 分析特异性以及阴性参考品符合率。
        样本线性：依据 YY/T 1182-2020 的相关要求，在线性范围内，取接近线性范围上限的高值样本按一定比例（如 5 倍或 10 倍）稀释为至少 5 种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限，将每一浓度样本检测 1 次或多次，计算每一浓度的对数均值和稀释比例(或理论浓度)的对数值，以浓度的对数均值为 Y，稀释比例(或理论浓度)的对数值为 X 进行线性拟合，计算其线性相关系数 r。
        分析特异性验证：验证需避免工艺杂质对检测结果的干扰，必要时可对样本进行核酸提取纯化。为避免基质干扰和保证检测有效性建议使用纯度较高的 DNA 进行相应稀释后来做验证。
        精密度/定量限：验证时，如需同时配制标曲，需控制 CV，避免重复操作过多，CV 偏大影响标曲建立和精密度/定量限验证。
        数据分析：由于仪器不同，数据阈值线会存在区别，故在数据分析时需依据实际情况统一阈值线再进行数据分析比较。
        样本核酸提取纯化：可与“宿主细胞残留 DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒”配合使用。该试剂盒主要用于生物制品样本中微量核酸的提取，可精准抽提各种生物制品中宿主细胞残留 DNA，适 用于多种基质缓冲溶液，可有效提取纯化微量的 DNA。
产品性能指标：
线性范围：300pg/µL-0.03pg/µL； 
标准品线性：R2≥0.980，扩增效率 90%≤Eff（%）≤110%，各浓度检测值 CV<15%。 
准确度（加标回收率）：70%-130%。 
定量限：0.01pg/µL，CV≤20%，测量偏差不大于|±20%|。 
精密度(重复性)：高、中两个浓度参考品各 10次，变异系数CV<15%。 
分析特异性：考察生物制品生产中常用的 DNA 对检测试剂盒的干扰，干扰组应与对照组重合，未见干扰。 
阴性参考品符合率：NTC 为 Undetermined 或 Ct 值>35。 
适用机型（包括但不限于）：ABI QuantStudio 3，ABI 7500 等。
冻融稳定性：5 次以上。

【注】：标准曲线浓度点可根据实际验证结果进行选择，应至少包含 5 个浓度点。
已融化未使用的 DNA 稀释液可在 2-8℃短暂保存，若长期不使用，请储存于-20℃。 稀释方法可根据实验需要进行调整。
（3）qPCR 加样：
   ①将所需试剂置于冰上操作，轻微振荡混匀，瞬时离心，加样（总体积 30μL）：
表 4 MIX 各反应孔加样示例

   ②实验可使用无菌无酶的八联管或者 96 孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心至管底准备反应。
（4）qPCR 反应程序参数设置：
以美国 ABI 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.06 为例。
       1)在Experiment Propertie s 页面创建空白新程序如图所示 ：

①Experiment name：修改实验名称。
②Experiment type： 选择程序（Quantitation-Standard Curve）。
③Reagents：选择实验方法（TaqMan ® Reagents ）。
    2)创建该产品检测探针，选择①界面，点击②创建探针，在TargetName中编辑探针名称并命名，在Reporter③和Quencher④中选择所需的荧光基团和淬灭基团。本产品荧光基团选择FAM，淬灭基团为None，参比荧光为ROX。点击⑤创建样品，在相应的Samplename⑥一栏中命名样品的名称。

    3) 在 Plate Setup ①界面，将标准曲线孔在 Task② 一栏设置为“S”③，并且在 Quantity④一栏分别赋值设为 300，30，3，0.3，0.03（单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample name 一栏中命名为ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。在 Plate Setup ①界面中，将无模板对照 NTC 孔在 Task②一栏设置为“N”⑤，将待测样本孔在Task②一栏设置为“U”⑥，并且在相应的 Sample name 一栏中命名样品的名称。（图例仅供参考）

     4) 设 置 反 应 程 序 ：

      5) 点 击 Run 界 面 的 “Start Run”按 钮 进 行 PCR 测 定 。

三、结果分析：
以美国 ABI 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.06 为例。
1、在 Analysis 的 Amplification Plot①面板中，点击 Reanalyse②，初步查看扩增曲线的形态是否正常。在 Analysis 的 Standard Curve③面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、R 2和扩增效率（Eff%）④等。在 Analysis 的 View Well Table⑤面板中，Quantity Mean 一栏可读取待测样本的检测值，单位为 pg/μL。（图例仅供参考）

2、结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。