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rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit
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4℃保存,有效期1年。
爱必信(上海)生物科技有限公司
4℃保存,有效期1年。
10T/50T
规格: | 10T | 产品价格: | ¥600.0 |
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规格: | 50T | 产品价格: | ¥2400.0 |
产品描述 | |||||||||||||||||||
描述 | rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit 是一款能够高效完成免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验的试剂盒。其包含高性能 rProtein A/G MagPoly Beads,能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液,为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件,增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白 A/G(约 14 kDa),同时拥有蛋白 A 和蛋白 G 的 IgG 结合结构域,具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样,既可以用低 pH 的洗脱液将免疫复合物从蛋白 A/G 磁珠上洗脱,也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物,直接进行后续检测分析。 本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。 产品组分:
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使用方法 | 1. 缓冲液的准备: 可使用试剂盒准备的缓冲液,也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。Lysis/Wash Buffer(5x)在使用前请稀释至并标记为 1xLysis/Wash Buffer,另根据需求,补加终浓度为 0.1%-1% 的Lysis/Wash Buffer Enhanced,标记为 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced)。所有缓冲液在使用前建议用 0.22 um 或者 0.45 um 滤膜过滤,稀释后的缓冲液建议 4°C保存,若试剂浑浊,请立即丢奔。 下列可能用到的试剂及材料未提供,需额外准备: (1)电泳上样缓冲液,非还原性(5×):0.3 M Tris-HCl,pH 6.8,5% SDS,50% 甘油0.5% 溴酚蓝 (2)二硫苏糖醇 (DTT) (3)蛋白酶抑制剂 (4)免疫沉淀所用抗原、抗体 2. 样品准备: 方案1:贴壁细胞的裂解 (1)小心去除单层纽胞的培养基。 (2)用预冷PBS 清洗细胞两次。 (3)根据表2的推荐体积向细胞中加入预冷的 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced)。冰上孵育 5min,期间混匀几次。 (4)将上达裂解好的样品转移至一个新的离心管中,约 13000xg 离心 10 min,分离细胞碎片。 (5)将上清转移到一个新管中,进行蛋白浓度测定及后续实验,标记为细胞裂解样品。
方案2:悬浮培养细胞的裂解 (1)将细胞悬液以 1000×g 离心 5min,收集细胞,奔上清。 (2)用预冷 PBS 将细胞团轻轻重悬,将细胞悬液以 1000×g 离心15min,收集细胞,奔上清。 (3)向细胞团块中加入预冷 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced)。每 50mg细胞团块使用 500ul。 (4)将上述裂解好的样品在冰上孵育 5min,期间混匀几次。13000×g 离心 10min,去除细胞碎片。 (5)将上清转移到一个新管中,备蛋白浓度测定及后续实验,标记为细胞裂解样品。 3. 免疫沉淀 抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整,不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量均有影响,以下方案为推荐常用的实验方法。 3.1 磁珠漂洗: (1)将 rProtein A/G MagPoly Beads 充分混匀,取 20ul (0.2 mg) 加入 1.5ml离心管中。 (2)向磁珠中加入 180ul 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),轻微涡旋混匀。 (3)将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清。 (4)向离心管中加入1ml 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清。 3.2免疫沉淀: 方案1: (1)向上述准备好的磁珠(步骤 3.1)中加入抗体,抗体推荐用量2-10ug,用抗体保存液或 1×Lysis/Wash Buffer 补充体积至 500ul,室温混旋孵育 30min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。 注:孵育温度和时间范围推荐为:室温、30min-2h,或者 4°C、1h-16h,根据实际的结合效果进行调整。 (2)向离心管中加入 500ul 1×Lysis/Wash Buffer,颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min,将离心管置于磁分离器上;待磁珠全部吸附后,吸弃上清,重复至少两次。 (3)向离心管中加入 500ul 细胞裂解样品(步骤2),每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为 500-1000ug,体积不足500ul可用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 补足,室温混旋孵育 30min,将离心管置于碳分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。 注:孵育温度和时间范围推荐为:室温、30min-2h,或者 4°C、1h-16h,根据实际的结合效果进行调整。 方案2: (1)在离心管中,将细胞裂解样品(步骤2) 与抗体混合孵育 30min。推荐抗体用量为 2-10ug,每个免疫沉淀反应推荐的细胞裂解液总蛋白量为 500-1000ug,体积不足建议用 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 将样品体积调整至 500ul。 (2)将孵育后的样品加入准备好的磁珠(步骤 3.1)中混旋孵育。 注:孵育温度和时间范国推荐为:室温、30 min-2h,或者 4°C、1h-16h,根据实际的结合效果进行调整。 (3)将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。 3.3碰珠漂洗: (1)向离心管中加入 500ul 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),颠倒离心管数次或轻做涡旋混匀 1min,将离心管置于磁分离吸附后,待磁珠全部吸附后,吸弃上清,重复一次。 (2)向离心管中加入 500ul 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),连同磁珠转移至一个新 EP 管中,颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清。 3.4 洗脱: 方案1:低pH洗脱 向离心管中加入50ul IP Elution Buffer,室温混旋孵育 10min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清为洗脱液,加入5-10 ul Neutralization Buffer。 方案2:备选洗脱方法(变性洗脱) 向离心管中加入50ul (1×),电泳上样缓冲液,将样品置于金属浴中,96-100°C加热 10 min。通过磁分离器分离磁珠,保留含有目的抗原的上样缓中液。 注:两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原,低pH 洗脱样本中抗体为完整结构,变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链,请根据后续实验需求选择洗脱方案。 |
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储存/保存方法 | 4℃保存,有效期1年。 | ||||||||||||||||||
注意事项 | (1)在进行免疫沉淀操作之前,请务必认真阅读此说明书。 (2)除非另有说明,所有操作建议于 4°C下进行。 (3)在保证洗杂效果的前提下,如果使用 1xLysis/Wash Buffer(Enhanced) 洗杂,会造成抗体和介质,或者抗原和抗体之问结合效果降低,建议可以使用 1xLysis/Wash Buffer 进行洗杂。 (4)磁珠应保存在储存溶液中,防止干燥,使用前请充分混匀。 (5)如果需要在还原条件下洗脱,向1×电泳上样缓冲液中加入DTT(终浓度 10-20 mM)。 (6)经煮沸后的填料易聚集并且失去抗体结合能力,经煮沸的填料不应再次使用。 (7)为保证最佳的实验结果,请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。 (8)对于免疫沉淀实验,不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,抗体与抗原结合还会受到的影响,因此,若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果,可自行优化缓冲液进行实验。 (9)实验设计时,建议加入对照组,以备后续实验结果分析。 (10)在确定实验结果前,建议保留各步骤抗原、抗体孵育后的样品以备验证。 |
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基本信息 | |||||||||||||||||||
别名 | 蛋白A/G磁珠IP试剂盒 |
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