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- 文献和实验
- 技术资料
- 库存:
10000⁺支
- 英文名:
human PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell).
- 保质期:
2年
- 供应商:
上海雅裕生物19121878899上海睿安生物
- 保存条件:
−196°C
- 规格:
100 Million/支
人PBMC细胞分离(冻存)19121878899上海雅裕生物
冻存细胞复苏说明书
复苏细胞采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短时间内融化,避免由于缓慢融化使水分深入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤,最大限度的保持细胞活力。
实验设备:恒温水浴锅、生物安全柜、微量移液器、离心机
试剂耗材:离心管,吸管若干,蓝枪头,不含钙镁的磷酸盐缓冲液(DPBS),含有 10%血清的 DPBS(血清可以替换成0.5%BSA/HSA ,若需培养可以换成相应的培养基)。
实验步骤:
1. 37℃水浴锅提前设置好,在离心管中预先加入 1-2ml含有10%血清的DPBS备用。
2. 从液氮取出冻存的细胞,将管盖旋开1/4,迅速拧紧后(防止由于热胀冷缩导致细胞冻存管炸裂),立即放入 37℃水浴锅中融化,并不时摇动使其尽快融化(动作尽量轻柔,避免造成细胞损伤)。
3. 细胞悬液融化好(冻存管内还保留少量冰晶)后,用蓝枪头小心吸取冻存液于离心管内,缓慢加入10%血清的 DPBS定容至14ml混匀(为了能够得到更多的细胞,请清洗冻存管壁和管盖 2-3 次)后准备离心。
4. 离心前,一定配平!400g,10min。
5. 小心弃掉上清液,缓慢加入含有 10%血清的DPBS 1~2ml,缓慢吹散细胞,根据不同的细胞规格补一定量的含有 10%血清的DPBS,混匀。
6. 取20μl细胞加入180μl的含有10%血清的DPBS混匀(具体稀释比例可参考不同细胞计数仪的置信区间浓度),吸取12μl稀释过的细胞与12μl的AO/PI染色液混匀后,上机计数。
注意事项:
1. 取出冻存管后,要迅速放入37℃水浴锅中融化,避免细胞缓慢融化而破坏细胞。
2. 离心时,避免转速过大或时间过长对细胞产生损伤,同时也不利于重悬细胞。可根据细胞用途调整离心转速,但转速较低,离心时间较短可能会造成细胞损失。
常用培养基:
|
细胞类型 |
常用培养基 |
添加因子 |
|
PBMC |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
/ |
|
CD3⁺ Pan T cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
IL-2/anti-CD3CD28 |
|
CD4⁺ T cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
IL-2 |
|
CD8⁺ T cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
IL-2 |
|
CD19⁺ B cells |
DMEM RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA α-MEM x-vivo |
/ |
|
NK cells |
DMEM RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA SCGM Medium |
IL-2 IL- 15 |
|
Neutrophils |
RPMI 1640(supplemented) |
G-CSF GM-CSF |
|
CD34⁺ stem/progenitor cells |
RPMI 1640(supplemented) |
SCF IL-3 IL-6 |
|
CD14⁺ Monocytes |
DMEM RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA |
GM-CSF(M1,M∅) M-CSF(M2 ,M∅) IL-4+GM-CSF (Dendritic cells) |
|
Dendritic cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA |
IL-4 GM-CSF |







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文献和实验人PBMC细胞分离(冻存)19121878899上海雅裕生物
冻存细胞复苏说明书
复苏细胞采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短时间内融化,避免由于缓慢融化使水分深入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤,最大限度的保持细胞活力。
实验设备:恒温水浴锅、生物安全柜、微量移液器、离心机
试剂耗材:离心管,吸管若干,蓝枪头,不含钙镁的磷酸盐缓冲液(DPBS),含有 10%血清的 DPBS(血清可以替换成0.5%BSA/HSA ,若需培养可以换成相应的培养基)。
实验步骤:
1. 37℃水浴锅提前设置好,在离心管中预先加入 1-2ml含有10%血清的DPBS备用。
2. 从液氮取出冻存的细胞,将管盖旋开1/4,迅速拧紧后(防止由于热胀冷缩导致细胞冻存管炸裂),立即放入 37℃水浴锅中融化,并不时摇动使其尽快融化(动作尽量轻柔,避免造成细胞损伤)。
3. 细胞悬液融化好(冻存管内还保留少量冰晶)后,用蓝枪头小心吸取冻存液于离心管内,缓慢加入10%血清的 DPBS定容至14ml混匀(为了能够得到更多的细胞,请清洗冻存管壁和管盖 2-3 次)后准备离心。
4. 离心前,一定配平!400g,10min。
5. 小心弃掉上清液,缓慢加入含有 10%血清的DPBS 1~2ml,缓慢吹散细胞,根据不同的细胞规格补一定量的含有 10%血清的DPBS,混匀。
6. 取20μl细胞加入180μl的含有10%血清的DPBS混匀(具体稀释比例可参考不同细胞计数仪的置信区间浓度),吸取12μl稀释过的细胞与12μl的AO/PI染色液混匀后,上机计数。
注意事项:
1. 取出冻存管后,要迅速放入37℃水浴锅中融化,避免细胞缓慢融化而破坏细胞。
2. 离心时,避免转速过大或时间过长对细胞产生损伤,同时也不利于重悬细胞。可根据细胞用途调整离心转速,但转速较低,离心时间较短可能会造成细胞损失。
常用培养基:
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细胞类型 |
常用培养基 |
添加因子 |
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PBMC |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
/ |
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CD3⁺ Pan T cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
IL-2/anti-CD3CD28 |
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CD4⁺ T cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
IL-2 |
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CD8⁺ T cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA AIMV |
IL-2 |
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CD19⁺ B cells |
DMEM RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA α-MEM x-vivo |
/ |
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NK cells |
DMEM RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA SCGM Medium |
IL-2 IL- 15 |
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Neutrophils |
RPMI 1640(supplemented) |
G-CSF GM-CSF |
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CD34⁺ stem/progenitor cells |
RPMI 1640(supplemented) |
SCF IL-3 IL-6 |
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CD14⁺ Monocytes |
DMEM RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA |
GM-CSF(M1,M∅) M-CSF(M2 ,M∅) IL-4+GM-CSF (Dendritic cells) |
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Dendritic cells |
RPMI 1640+10%FBS/AB 血清/HSA |
IL-4 GM-CSF |







人外周血PBMC的制备流程 收集抗凝人外周血,用 1640 无血清培养基或 PBS 按照 1:1 的比例稀释,上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。 在 15 mL 离心管中,先加入 3 mL 充分混匀的 Ficoll 液(1.077 g/mL),再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液,血液和 Ficoll 液分层明显为成功。 注:Ficoll 提前半小时从 4℃ 冰箱取出恢复到室温,温度过高会导致分离不明显,温度过低会导致密度过大,同样分离效果不好, 20~25℃ 最佳。。 将样本小心转移
g/mL,未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。 人 PBMC 中不同细胞类型的比例 PBMC 中大部分都是淋巴细胞,包括 B 细胞和 T 细胞,其中 CD3 T 细胞又占了淋巴细胞中绝大部分 (45 - 70%)。这些 T 细胞都处于初始(naive)状态,即已经成熟了但没有受到抗原
流式课堂 | 裂红 or 分离液?外周血不同制备方法应用场景
、粒细胞等),需要裂解红细胞;倘若检测的是红细胞,不需要裂解红细胞; ⊙ 如果后续样本不用于流式分析,而是需要培养或者冻存复苏,使用裂红后培养的细胞,活性可能会打折扣。 Ficoll 密度梯度离心法 01 原理 根据细胞的沉降系数差异,借助细胞分离液和离心操作,对细胞进行分离。 02 优点 ⊙ 获得的细胞更纯净,有利于细胞培养后检测胞内因子 ⊙ 可将细胞冻存后再复苏、培养、检测 ⊙ 去除死细胞 03 缺点 ⊙ 步骤复杂,需 30min 以上 ⊙ 取白膜层需要丰富的经验 ⊙ 只能获得淋巴细胞和单核
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