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- 表观生物根据Cell等权威杂志发表的相分离体内体外实验设计方法指南[3]，推出了以下一系列完备的蛋白相分离技术服务，包括相分离形成能力预测、相分离形成能力鉴定、相分离功能验证。
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- 2026年01月23日
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表观生物
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蛋白相分离系列技术服务
2009年，Science的一项研究提出“相分离”（phase separation）这个概念[1]；而近几年的研究表明，液-液相分离（LLPS：liquid-liquid phase separation）可能是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础，普遍存在于细胞各项生理过程中，比如某些转录调控的超级增强子等；在肿瘤、神经退行性疾病等疾病的发生发展过程中也起着非常重要的作用[2]，已经成为生命科学领域研究的热点，相关的文章近年来呈现井喷似的增长。 表观生物根据Cell等权威杂志发表的相分离体内体外实验设计方法指南[3]，推出了以下一系列完备的蛋白相分离技术服务，包括相分离形成能力预测、相分离形成能力鉴定、相分离功能验证。
一、蛋白相分离形成能力预测
蛋白相分离形成能力预测
通过生物信息学的前沿算法，可以对蛋白相分离形成能力进行一个初步的预测。
内容：利用机器学习建立的PSPHunter算法，基于蛋白氨基酸序列，整体预测蛋白相分离形成能力（赋分0.8以上为高成相能力蛋白）
二、蛋白相分离形成能力验证
细胞中最为常见的相分离是液态相分离结构。目前相分离研究领域认为[4]，鉴定相分离，需要以下的实验证明：
1. FRAP
2. 结构大小是否达到或接近微米级别
3. 活细胞成像
4. 体外重构
有鉴于此，表观生物推出了以下的蛋白相分离形成能力验证实验服务：
免疫荧光染色检测蛋白活细胞分布
内容：通过免疫荧光染色，检测目的蛋白的活细胞分布以及聚集情况。可同时检测两个蛋白的活细胞分布以及共定位情况（需要客户提供细胞以及目的蛋白抗体）
相分离荧光载体构建
内容：
（1）通过无缝克隆构建目的蛋白融合荧光蛋白（EGFP/RFP）的真核表达载体，可用于活细胞观察目的蛋白的相分离形成情况。
（2）通过无缝克隆构建目的蛋白融合荧光蛋白（GFP/mCherry）的原核表达载体，可用于原核表达纯化融合荧光的目的蛋白用于体外成相实验
原核表达纯化及蛋白体外成相实验
2012年，美国西南医学中心的研究团队发现在试管中分子通过微弱的作用力形成液滴，首次证实了相分离能够通过简单的生化实验在体外重复[5]。因此，相分离可以在体外通过纯化的蛋白以及核酸等在特定的条件下发生，体外重构的相分离实验对于该领域具有重要的作用。
内容：原核表达融合His-Tag以及荧光Tag的目的蛋白，经过镍柱亲和纯化，获得高纯度的目的蛋白。摸索适合的体外成相条件，观察目的蛋白的体外成相情况
蛋白融合荧光细胞系构建以及活细胞成相实验
内容：将目的蛋白融合荧光蛋白（EGFP/RFP）真核表达载体转染至目标细胞中，经过药物筛选构建稳定表达细胞系。利用构建成功的细胞系进行激光共聚焦活细胞成像，观察目的蛋白在细胞内成相情况
体外FRAP
荧光漂白恢复实验（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）常用于测量液滴的流动性，看所研究的蛋白是否在短时间内恢复荧光，这可以表明此种结构是否与周围环境在进行频繁的物质交换，辅助验证相分离。
内容：蛋白在体外体系形成相分离后，使用激光共聚焦显微镜观察相分离液滴经过光漂白之后，液滴淬灭区域荧光恢复情况，由此验证蛋白体外相分离液滴的流动性
细胞内FRAP
一个相分离结构验证标准：形成球状结构，能够融合，通过FRAP技术可证明其能够发生荧光漂白恢复。
内容：对于活细胞内形成的相分离液滴，使用激光共聚焦显微镜观察相分离液滴经过光漂白之后，液滴淬灭区域荧光恢复情况，由此验证细胞内相分离液滴的流动性
体外相分离融合及分裂
内容：蛋白在体外体系形成相分离后，使用激光共聚焦显微镜长时间拍摄模块，观察相分离液滴的融合及解聚现象，由此验证体外相分离液滴的流动性
细胞内相分离融合及分裂
活细胞成像实验，目的是观察液滴融合或分离现象。
内容：对于活细胞内形成的相分离液滴，使用激光共聚焦显微镜长时间拍摄模块，观察相分离液滴的融合及解聚现象，由此验证细胞内相分离液滴的流动性
三、蛋白相分离功能验证
蛋白关键相分离位点预测
内容：利用机器学习建立的PSPHunter算法，基于蛋白氨基酸序列，识别蛋白的关键相分离驱动氨基酸区段
蛋白成相突变体以及突变回补体构建及成像验证
为了验证相分离对于蛋白功能的直接影响，我们通常需要在破坏蛋白成相能力以及回补其成相能力之后，进行功能性的验证。
内容：在获得蛋白关键成相位点信息之后，在避开蛋白重要的功能性结构域的前提下，对于蛋白关键成相位点设计突变，破坏其相分离形成能力，并且通过融合表达已知具有相分离形成能力的蛋白无序区短肽（例如FUS IDR、hnRNPac1 IDR、polyG等）进行成相能力回补。而后，通过构建相关真核及原核表达载体，并且在细胞内以及体外对于成相突变体的成相能力进行验证
四、蛋白与蛋白相互作用促进相分离功能验证
体外X蛋白促进Y蛋白相分离
范例：RYBP体外促进CTCF相分离
例图11.体外实验中，RYBP 蛋白 液体与 CTCF 蛋白融合
五、TurboID鉴定相分离互作蛋白
传统方法（如免疫沉淀）在鉴定动态、瞬时、弱相互作用蛋白质方面存在局限性，包括无法呈现真实状态、会破坏瞬时相互作用和无膜细胞器等。
TurboID 邻近标记技术可在室温下直接在活细胞中加入无毒的生物素（biotin），对目标蛋白及其邻近蛋白进行快速标记（≥ 10 min），对细胞干扰小，标记尺度更短（~10 nm）等特点，在同类邻近标记技术（如 APEX、BioID 等）中表现优。
通过 TurboID 标记后的蛋白复合物，可分解肽段进行 LC-MS/MS，也可富集 RNA 进行转录组测序（例图15）。蛋白组分析和转录组分析结果示例如例图16和例图17所示。
例图15. TurboID 技术分析流程
例图16. TurboID蛋白组学分析结果示例[7,8]
例图17. TurboID转录组学分析结果示例[9]
TurboID 技术服务主要内容包括：
1.生物素标记效率验证（Western Blot）
2.液滴共定位验证（免疫荧光成像）
3.液滴互作蛋白图谱构建（定量蛋白质组学）
4.液滴互作转录组测序
服务项目列表
随着对相分离现象认识的深入，未来的重心聚焦于复杂的生物学功能。深入解析相分离的调控机制，精准精准识别并筛选关键驱动分子，将为靶向相分离调控细胞生理过程（如信号转导、基因转录、应激反应等）提供机遇。在临床转化方面，相分离研究正逐步拓展至肿瘤、神经退行性疾病、免疫紊乱等重大疾病领域，有望为疾病的早期诊断、精准治疗和预防干预开辟崭新的路径。 伴随科研成果的不断涌现，相分离靶向药物的研发也日益受到医药产业的关注，有望成为生物医药领域新的增长点。 表观生物期待与您携手，共同探索相分离这一充满挑战与机遇的科学前沿！
未来，相分离研究的重点是它的生物学功能。探究相分离的机制，寻找和筛选相分离的关键分子，有利于以相分离为靶点，改造细胞生理过程，比如信号转导、转录调控、应激反应等等；在临床转化方面，相分离相关研究可延伸至肿瘤、免疫等方面，为疾病防治提供广阔的思路。
表观生物愿与您一道探索相分离这广袤而迷人的领域！
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文献和实验1. C. P. Brangwynne et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729-1732 (2009).
2. S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen, Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 285-298 (20 17).
3. M. Kato et al., Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell 149, 753-767 (2012).
4. Berry, J et al., Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Reports on Progress in Physics, 81(4), 046601(2018).
5. P. Li et al., Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336-340 (2012).
6. Wei C, Jia L, Huang X, et al. CTCF organizes inter-A compartment interactions through RYBP-dependent phase separation. Cell Res. 2022;32(8):744-760.
7. Zhao C, Cai S, Shi R, et al. HERD-1 mediates multiphase condensate immiscibility to regulate small RNA-driven transgenerational epigenetic inheritance. Nat Cell Biol. 2024;26(11):1958-1970.
8. Soto JS, Jami-Alahmadi Y, Chacon J, et al. Astrocyte-neuron subproteomes and obsessive-compulsive disorder mechanisms. Nature. 2023;616(7958):764-773.
9. Ramelow CC, Dammer EB, Xiao H, et al. Simultaneous profiling of native-state proteomes and transcriptomes of neural cell types using proximity labeling. Preprint. bioRxiv. 2025;2025.01.29.635500. Published 2025 Feb 1.
文献速递｜Nature Communications：TRIM25 通过相分离调控抗病毒应激颗粒形成及先天免疫应答
TRIM25-G3BP1 相互作用是如何促成其共相分离发生的，研究人员构建了一系列 TRIM25 截短突变体，并将「PTFG」鉴定为 TRIM25 结合 G3BP1 所需的最小氨基酸片段（数据未展示）。将 mCh-TRIM25（WT 或 ∆PTFG）和 GFP-G3BP1 共转染到 HeLa 细胞中，并使用四川大学生物治疗全国重点实验室平台奥伟登（Evident）SpinSR 转盘共聚焦（奥伟登（Evident）现已推出全新 IXplore IX85 SpinSR 转盘共聚焦显微镜）快速成像和快速超
Science：学术「自嗨」还是开创性的发现？ 聚焦「相分离」研究引发的学术争议
对其进一步做单分子追踪实验后却发现，复制区室相比于周围的核质环境，其分子扩散速率并未变慢 [7]，这显然不符合 LLPS 稠密区域内分子扩散速率将更加缓慢的特征。实际上，后来的研究发现这一复制区室是通过 DNA 招募相应的蛋白质所形成的。 图片来源：elife 前进的方向：定量新技术的出现为了更加准确的鉴定和研究细胞内的 LLPS，研究者们迫切需要新的技术手段，而目前也已经出现了一些令人振奋的成果。光学显微镜和光谱学的发展使得人们可以定量的测定和比较相分离体系中蛋白质的绝对丰度。单分子追踪技术也将取代
细胞膜 [2] 。PM 比其他膜带更多的负电荷并且因此可以有效地跟其他细胞膜分离。但这种做法需要一个特殊的自由流电泳仪装置。 ( 3 ) 用两相分离法分离 PM 部分依赖于膜囊泡之间不同起源的表面特性。这一技术潜在的原则是众多的水溶高分子质量的聚合物超过一定浓度不相互混合，而是形成分离相，每个分离相包含 85% 以上的水。这种含聚合物的分离相很适合做生物分析材料。根据不同的表面特性加入的膜在水性聚合物相之间被分离这项技术最初由 Laesson 等 [ 3 ]描述，现在由于它实现了 PM 蛋白的高产和没有
