本试剂盒仅供科研使用
葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GCDH)试剂盒说明书
(WS2180W 微板法 96 样)
一、产品简介:
GCDH(EC 1.1.1.47)属于氧化还原酶家族,催化 D-葡萄糖和 NAD(P)生成 D-葡萄糖酸和 NAD(P)H,
参与戊糖磷酸途径。GCDH 催化 D-葡萄糖和 NAD 生成 D-葡萄糖酸和 NADH,在 340nm 下测定 NADH 上
升速率,即可反映 GCDH 活性。传统方法是检测 NADH 在 340nm 处的吸光值。由于 NADH 的摩尔消光系
数(
ε)较低,所以这种方法灵敏度低,且严重受到干扰。
本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:该酶促过程产生的 NADH 与特异的显色剂反应,产
生在 450nm 处有最大吸收峰的有色物质,通过检测该有色物质在 450nm 的增加速率,进而计算出葡萄糖脱
氢酶活性的大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
临用前加入 19mL 试剂一充分溶解,
用不完的试剂仍 4℃保存。
试剂三
液体 1.1ml×EP 管
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、葡萄糖脱氢酶(GCDH)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免
实验样本和试剂浪费!
1、样本制备
① 组织样本:
建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm, 4℃离心 10min,
取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可以按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 细菌/培养细胞:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取
液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30
次);12000rpm, 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比
例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm。
② 试剂放在 37℃水浴 5min;
③ 在 96 孔板中按照下表依次加入试剂:
试剂名称(μL)
测定管
样本
10
试剂二
180
试剂三
10
混匀,立即 450nm 下读取 A1 值,20min 后读取 A2 值,
ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用
【注】:若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:30min 或更长),重新调整的反应时间值要代入计算公式重
新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.1009x + 0.0002;x 是 NADH 摩尔质量:nmol,y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算
单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单
位。
GCDH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.0002)÷0.1009]÷(V1×Cpr) ÷T=49.6×(ΔA-0.0002)
÷Cpr
3、按样本鲜重计算
单位定义:每克组织每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0002)÷0.1009]÷(W ×V1÷V)÷T=49.6×(ΔA-0.0002)
÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCDH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0002)÷0.1009]÷(500×V1÷V) ÷T=0.1×(ΔA-0.0002)
V----加入提取液体积,1 mL;
V1----加入样本体积,0.01 mL;
T----反应时间,20 min;
Cpr----样本蛋白质浓度,mg/mL;
W----样本质量,g;
500----细菌或细胞总数,500 万。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸馏水(母液需在两
天内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2,0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol /μL。也可根据实际
样本来调整标准品浓度。
3 依据加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。
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