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NAD+-山梨醇脱氢酶(NAD+-SDH)试剂盒,微板法

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  • wksubio
  • WS9550W
  • 国内
  • 2025年12月31日
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    • 英文名

      NAD+- Sorbitol Dehydrogenase (NAD+- SDH) Kit

    • CAS号

      WS9550W

    • 保质期

      3个月

    • 供应商

      上海瓦兰生物

    • 保存条件

      4℃

    • 规格

      96T

    本试剂盒仅供科研使用
    NAD+ -山梨醇脱氢酶活性测定试剂盒说明书
    (货号:WS9550W 微板法 96 样)
    一、产品简介:
    山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenaseSDH催化山梨醇脱氢生成果糖,是调控
    生物体内山梨醇含量的关健酶之一,依据依赖的辅酶分为 NAD+依懒性山梨醇脱氢酶
    NAD+ -SDHEC 1.1.1.14)和 NADP+依懒性山梨醇脱氢酶(NADP+ -SDH),
    NAD+ -SDH 催化山梨醇转化成果糖,NADP+ -SDH 催化山梨醇转化成葡萄糖。
    NAD+ -SDH 催化山梨醇脱氢生成果糖,同时还原 NAD+生成 NADH,测定 340nm
    吸光度增加速率可以计算 NAD+ -SDH 酶活性大小。
    二、试剂盒组成和配制:
    试剂名称
    规格
    保存要求
    备注
    提取液
    液体 100mL×1
    4℃保存
    试剂一
    粉剂 mg×1
    4℃保存
    临用前甩几下使粉剂落入底部,
    再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
    试剂二
    液体 20mL×1
    4℃保存
    试剂三
    粉剂 mg×1
    4℃保存
    临用前甩几下使粉剂落入底部,
    再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
    三、所需的仪器和用品:
    酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
    四、NAD+ -山梨醇脱氢酶(NAD+ -SDH)活性测定:
    建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实
    验样本和试剂浪费!
    1、样本制备:
    ① 组织样本:
    称取约 0.1g 组织(水分充足样本可取 0.5g 组织),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。
    12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
    【注意】 若样本颜色较深(如植物叶片),可引起起始值 A1 值较大如超过 1.6,可在样本制备过程中
    增加除色素步骤:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 80%乙醇冰浴匀浆,12000rpm
    4离心 10min,弃掉色素较深的上清液;以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的沉淀中加入
    1mL 提取液,混匀或再次冰浴匀浆,12000rpm4离心 10min,取上清置冰上待测。
    ② 细菌/细胞样本:
    先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取
    液;超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30
    次);4ºC 12,000rpm 离心 10min,取上清作为待测样品。
    【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。
    3 液体样本:澄清的液体样本直接检测;若浑浊离心后取上清检测。
    2、上机检测:
    ① 酶标仪预热 30min 以上,设置温度 25,调节波长至 340nm
    ② 所有试剂放在 30℃水浴 5min
    ③ 在 96 孔板中依次加入:
    试剂名称(
    μL
    测定管
    样本
    20本试剂盒仅供科研使用
    2
    试剂一
    10
    试剂二
    160
    混匀,25℃下孵育 10min
    试剂三
    10
    混匀,25℃下,20s 时于 340nm 处读取 A1
    20min 后读取 A2ΔA=A2-A1
    【注】: 若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:40min 或更长)再读取 A2,或加大样本体积 V1
    (如增至 40μL,则试剂二相应减少),重新调整的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入
    计算公式重新计算。
    五、结果计算:
    1. 按样本蛋白浓度计算:
    酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    NAD+ -SDHnmol/min/mg prot=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr
    2. 按样本鲜重计算:
    酶活定义:每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    NAD+ -SDHnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(W×V1÷V) ÷T=160.8×ΔA÷W
    3. 按细菌或细胞密度计算:
    酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    NAD+ -SDHnmol/min/104 cell=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.32×ΔA
    4. 按照液体体积计算
    酶活定义:每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    NAD+ -SDHnmol/min/mL= [ΔA×V2÷ε×d×109]÷V1÷T=160.8×ΔA
    ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm
    d---96 孔板光径,0.5cm
    V---加入提取液体积,1 mL
    V1---加入样本体积,0.02 mL
    V2---反应体系总体积,2×10-4 L
    T---反应时间,20 min
    500---细菌或细胞总数,500 万;
    W---样本质量;
    Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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