本试剂盒仅供科研使用
NADP+ -山梨醇脱氢酶活性测定试剂盒说明书
（货号：WS3750F 紫外分光法 48 样）
一、产品简介：
山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控
生物体内山梨醇含量的关健酶之一，依据依赖的辅酶分为 NADP+依懒性山梨醇脱氢
酶（NADP+ -SDH，EC 1.1.1.B60）和 NAD+依懒性山梨醇脱氢酶（NAD+ -SDH），
NADP+ -SDH 催化山梨醇转化成葡萄糖，NAD+ -SDH 催化山梨醇转化成果糖。
NADP + -SDH 催化山梨醇脱氢生成葡萄糖，同时还原 NADP +生成 NADPH，测定
340nm 吸光度增加速率可以计算 NADP + -SDH 酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，
再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
试剂二
液体 35mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，
再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
三、所需的仪器和用品：
紫外分光光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅、可调式移
液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、NADP+-山梨醇脱氢酶（NADP+-SDH）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实
验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上
清，置冰上待测。
【注意】 若样本颜色较深（如植物叶片），可引起起始值 A1 值较大如超过 1.6，可在样本制备过程中
增加除色素步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 80%乙醇冰浴匀浆，12000rpm，
4℃离心 10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的沉淀中加入
1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取
液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30
次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测；若浑浊离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 紫外分光光光度计预热 30min 以上，设置温度 25℃,调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂放在 25℃水浴 5min；
③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管本试剂盒仅供科研使用
2
样本
60
试剂一
20
试剂二
660
混匀，25℃下孵育 10min
试剂三
20
混匀，25℃下，20s 时于 340nm 处读取 A1，20min
后读取 A2。ΔA=A2-A1。
【注】：若ΔA 过小，可以延长反应时间（如：30min 或更长）再读取 A2，或加大样本体积
V1（如增至 100μL，则试剂二相应减少），重新调整的反应时间 T 和加样体积 V1 需
代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1. 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP + -SDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=101.8×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP + -SDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=101.8×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算：
酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP + -SDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.2×ΔA
4. 按照液体体积计算
酶活定义：每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP + -SDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=101.8×ΔA
ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；
d---光径，1cm；
V---加入提取液体积，1 mL；
V1---加入样本体积，0.06mL；
V2---反应体系总体积，7.6×10-4 L；
T---反应时间，20 min；
500---细菌或细胞总数，500 万；
W---样本质量；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
文献和实验
