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- 本实验使用过表达human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。该病毒的表达框为pLenti-CMVOct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV启动子驱动Oct-4-EGFP基因的表达， 同时由PGK启动子驱动 puromycin抗性基因的表达。
- 2026年06月23日
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- 文献和实验
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- 服务名称：
稳定细胞株筛选
- 提供商：
XSL
关键词：Oct-4-EGFP，稳定细胞株， HeLa，慢病毒
一、 实验原理
外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。前者外源 DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。 传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选， 最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株， 该方法阳性率低，周期长，工作量大。慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。 利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
二、 实验目的
通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。
三、 实验步骤
实验共分以下3个主要步骤：
1. 细胞铺板 将HeLa细胞按30%的融合度接种到24孔板：
1) HeLa细胞配成1×105 cells/mL细胞悬液，待铺板。
2) 每孔铺500μL，即5×104 cells/well，铺1块24孔板。
2. 感染慢病毒 12~20h后感染慢病毒：
1) 根据公式计算病毒用量： （细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。
2) 本实验中MOI取10，吸去与加入病毒体积相同培养基。
3) 每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene终浓度达到5μg/mL。
4) 24h后换，弃去培养基后每孔加入500μL新鲜的培养基。
3. 稳定株筛选
1) 72h以后，加入终浓度2μg/μL puromycin。每隔2-3天换一次终浓度2μg/μL puromycin新鲜培养基。
2) 药物筛选约10天后，拍荧光照片。
3) 稳定细胞株冻存。
四、 实验结果
图1. 慢病毒感染HeLa细胞72h后荧光照片，MOI为10 图2. 慢病毒感染HeLa细胞，筛选10天后稳定株荧光照片
结论：从图1可以看到，在MOI为10条件下，HeLa的感染效率约为80%。根据图2，使用puromycin药物筛选10天后，表达目的基因的HeLa的比例在90%以上，且荧光亮度增强。Oct-4-EGFP稳定表达的HeLa细胞株筛选成功。
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文献和实验稳转株构建过程中，一个看似简单但经常出问题的问题： 抗生素筛选到底要筛多久？"筛个两三天"和"筛一两周"差别在哪？怎么判断筛选到位了？ 先说结论： 筛选时长不是固定天数，而是一个状态：从感染后 48~72h 开始加药，至少筛选 48h，直到"野生型对照孔全部死亡、实验组存活稳定、（带荧光时）阳性率达到 100%"——这个过程通常 1~2 周。之后转入维持培养（筛选浓度的 1/2~1/4 或更低），才算完成整个筛选阶段。 时间线安排： 感染 → 48~72h 后加药 → 筛选 ≥48h
辛苦几周筛出来的稳转株，交付或使用前最后一个问题： 稳定细胞株怎么验证？验证哪些指标、用什么方法、做到什么程度才算"合格"？ 先说结论： 稳转株验证分三层：分子层面（qPCR/WB 确认表达或敲低、编辑类加 PCR 测序基因型确认）、细胞层面（支原体、活力、生长状态）、功能层面（表型实验与预期一致）。三层都过，细胞株才能放心用、放心传、放心写进论文。 验证顺序建议： 分子验证 → 细胞质检 → 冻存复苏复检 → （编辑类）基因型确认 → 功能验证 --- 一、分子层面：表达/编辑效果验证
想长期表达某个基因，但它一高表达细胞就死、一过表达表型全是"中毒"——这时候很多老师会想到诱导表达系统： Tet 诱导稳定细胞株（Tet-On）怎么构建？和普通稳转株差在哪？诱导倍数怎么验证？ 先说结论： Tet 诱导稳转株的核心是把"表达开关"装进稳转系统：细胞先稳定表达调控蛋白（Tet-On 的 rtTA），再引入由 TRE 应答元件控制的目的基因。平时不表达或低表达，加入诱导剂（多西环素 doxycycline）后才按剂量诱导表达。构建框架仍是"感染 → 筛选 → 验证 → 冻存
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