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- ELISA（酶联接免疫吸附反应分析）是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
- 2025年07月11日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 服务名称：
国产ELISA试剂盒96Tkit
- 提供商：
XSL
实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法 以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。目前我们对客户提供比较常用的ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法服务。
技术流程
双抗体夹心法(检测未知抗原)
- 用缓冲液将抗体稀释至1-10ug/ml。在反应孔中加0.1ml， 4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。
- 加样：加一定稀释的待检样品0.05ml于上述已包被之反应孔 中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及 阳性对照孔)。
- 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴 定后的稀释度)0.05ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。
- 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液 0.1ml，37℃ 10～30分钟。
- 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml
间接法(检测未知抗体)
- 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1-10ug/ml， 每孔加 0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
- 加样：加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.05ml于上述 已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空 白、阴性及阳性孔对照)
- 加酶标抗体：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二 抗体(抗抗体)0.05ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一 遍用DDW洗涤。
- 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底 物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。
- 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml
- 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD 值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
结果展示：
实验完成周期及交付标准 ：
- 实验周期：1-3天
- 交付标准：ELISA检测原始OD值、ELISA检测标准曲线、ELISA检测目的蛋白浓度值、柱状图、实验报告（实验步骤、试 剂、仪器等）
- 液体类标本（细胞培养上清、组织匀浆、血清、血浆、尿液、胸水、腹水、脑脊液等）；
- 样本保存：请尽早检测，2-8℃保存一天；需更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存。如需周期收集样本，请将样本及时 分装标号后，置-20℃或-70℃保存；
- 请提前告诉我们：您样本的种属、样本数量、待测指标及其他特殊要求。
- ELISA标准曲线；
- 详细的实验步骤；
- 完整的实验报告（试剂耗材，实验方法，实验结果及结果说明）。
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文献和实验运用Cell Based Elisa检测信号通路蛋白和磷酸化蛋白
using Phospho-p38 and Total-p38 antibodies (C). Cell-Based Elisa将小鼠巨噬细胞4/4细胞种在96孔板内，每个孔种5 x 104 cells/cm2细胞。细胞用不同浓度的anisomycin刺激，我们来监测P38 MAPK和JNK两种蛋白的变化。按照试剂盒的实验步骤，分别固定，打孔，猝灭，封闭，然后一抗孵育，二抗孵育，最后显色，用常规的酶标仪读取数值。最后数据再和试剂盒提供的结晶紫核染料结果做纠正，最后得出以上数据。Quantitative
微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 四、温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素
产生假阳性反应。一般说来，在 3 天内测定的血清标本可放置于 4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 2. 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA 中用的蒸馏水或去离子
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