免疫荧光（石蜡-三标）

免疫荧光
        免疫荧光技术又称为荧光抗体技术，将荧光标记技术和免疫学方法结合起来，利用抗原抗体相互作用从而对组织或细胞内的 抗原或抗体物质进行定位、示踪、定性以及相对定量等。

 
实验意义

1. 免疫荧光技术特异性强、敏感性高、反应速度快、结果清晰明确，在临床检验和科学研究工作上有很高的应用价值。
2. 操作简便，便于推广。

实验步骤

一、脱蜡至水 

1. 石蜡切片56℃ 预热3h。
2. 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ 各5min脱蜡
3. 无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ复水2min。
4. 95%、90%、80%、70%的乙醇各2min。
5. 去离子水洗3min。
6. 1×PBS洗3min×2次。

二、抗原修复 

1. 切片置0.01M PH6.0 柠檬酸盐缓冲液中再放入高压锅，盖上盖子及高压阀，待有蒸汽冒出开始计时加热 15min。（或CB液中微波中高火5min煮沸，然后中火维持沸腾20min），将高压锅置流水下冲洗减压，安 全打开高压锅。 7’. 将切片置于0.01mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火 力维持10分钟，停止加热后自然冷却至室温。（煮沸6分钟×4次可能更好）。
2. 让载片在原柠檬酸盐缓冲液中自然冷却至室温，降至室温前切勿取出。
3. PBS浸洗2分钟后滴加0.3%tritonX-100透膜剂透膜12分钟（不透膜也没关系，反正细胞早就被切开了）。但注意细胞膜表面的整合蛋白不能加tritonX-100,否则会被洗掉。
4. PBS洗3minX2次。

三、免疫标记
1. 甩干PBS，正常山羊血清在湿盒中37℃封闭30分钟。 
2. 甩去山羊血清，勿洗，种属来源不同的Ab1和Ab2按适当比例混合后滴加于切片样品位置，湿盒中4℃ 过夜（或37℃ 2h）。注意设置对照.（对照可分为阴性对照、阳性对照和空白对照，根据实验需要设 置）。 
3. 室温复温45min。 
4. PBS洗3min×5次。 
5. 甩去PBS，滴加相应的适当浓度的二抗（我这里使用FITC标记的二抗与Ab1结合，TRITC标记的二抗 与Ab2结合）。37℃湿盒中孵育1h。 
6. PBS洗5min×3次。
7. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果佳。 18. PBS洗2min×4次 
8. 封片剂封片，荧光显微镜观察或显微照相。 

注意： 

1. 在实验过程中勿使切片样品变干，以免影响实验效果。
2. 若一张切片同时做两种抗体的免疫荧光，则加一抗时可将两种一抗按各自所需的浓度混合，但要注意抗 体要来源于不同的动物。加二抗时也可将两种二抗按各自所需的浓度混合，但要注意二抗要有不同的颜 色。
3. 第7步和第7'步任选一。

       
大鼠造血干细胞免疫荧光三标图片（图中核标为蓝色，细胞质标记为红色，细胞膜标记为绿色，红绿共标记区为黄色，红、 绿、蓝共标记区为白色）。

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