本试剂盒仅供科研使用
非蛋白巯基含量测定试剂盒说明书
(货号:WS1210W 微板法 48 样)
一、产品简介:
巯基化合物在生物体内具有重要的解毒功能,可与烯烃类、氢氢酸、醛类、环氧化物、
砷和很多重金属产生反应。因此,在动植物受到某些化学毒物干扰后,巯基含量有可能降
低,其中非蛋白巯基成分下降得更快。
本试剂盒采用 Ellman 方法,由 DTNB 与样品中的巯基进行反应,在 412nm 处有特征吸
收峰,可通过该吸光值计算出非蛋白巯基的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 13mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
液体 1mL×1 支
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、可调式移液器、甲醇。
四、非蛋白巯基(NPT)的测定:
1、样本制备
① 组织样本
称取约 0.1g 组织,加入 0.4mL 提取液,进行冰浴匀浆。然后加入 0.8mL 甲醇,室温
震荡 10min(防止液体蒸发丢失,可加甲醇补齐),12000rpm,4℃离心 10min,取上清
置冰上待测。
【注】:①根据实验室条件,可先液氮研磨,再加提取液,进行冰浴匀浆。
②根据研究需求,可按组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:10 的比例进行提取。
② 液体样本
取 0.1ml 液体,加入 0.4mL 提取液,进行冰浴匀浆。然后加入 0.8mL 甲醇,室温震
荡 10min(防止液体蒸发丢失,可加甲醇补齐至 1.3mL),12000rpm,4℃离心 10min,
取上清液置冰上待测。
2、上机检测
① 酶标仪预热 30min,设置温度在 25℃,设定波长为 412nm。
② 所有试剂在使用前均须在室温或 25℃水浴锅中温育 10min。
③ 在 96 孔酶标板中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样品
30
30
蒸馏水
试剂一
120
140
试剂二
20
混匀,25℃静置 2min,于 96 孔板,测定 412nm 吸光
值,ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。
【注】:若加入试剂二有白色浑浊产生,立即混匀样本即可恢复澄清。本试剂盒仅供科研使用
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五、结果计算:
1、标准曲线方程:y=1.0702x + 0.0012,x 为标准品摩尔质量(μmoL/mL);y 为ΔA。
2、按样本质量计算:
非蛋白质巯基含量(μmoL/g 鲜重)=[(ΔA-0.0012)÷1.0702×V1]÷(W×V1÷V)
=1.12×(ΔA-0.0012)÷W
3、按液体体积计算:
非蛋白质基含量(μmol/mL)=[(ΔA-0.0012)÷1.0702×V1]÷[(0.1×V1÷(V+0.1)]
=12.14×(ΔA-0.0012)
V---上清液总体积,1.2mL;
V1---加入样本体积,0.03 mL;
W---样本质量,g;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1μmol/mL):标准品溶解在 2mL 蒸馏水中。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.μmoL/mL。也可根
据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据加样表的测定管操作,根据结果即可制作标准曲线。