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过氧化物酶(POD)试剂盒,微
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Peroxidase assay kit
3个月
瓦兰生物
4℃
96T/196T
过氧化物酶(Peroxidase,POD)试剂盒(货号:WS7010W 微板法 96 样)一、产品简介:过氧化物酶(POD,EC 1.11.1.7)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是普遍存在的一种重要的氧化还原酶,其活性高低与抗性密切相关。在过氧化物酶催化下,H2O2 氧化愈创木酚生成红棕色产物,该产物在 470nm 处有最大光吸收,故可通过测 470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。二、试剂盒组分与配制:试剂名称规格保存要求提取液液体 110mL×1 瓶4℃保存试剂一液体 5mL×1 瓶4℃保存试剂二液体 30mL×1 瓶4℃保存试剂三液体 1mL×1 支4℃保存三、所需的仪器和用品:酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。四、过氧化物酶(POD)的测定:建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!1、样本制备:① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.25g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。2、上机检测:① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 470nm。② 测定前将试剂一、二和三解冻至室温(25℃)。③ 在 96 孔板中依次加入:试剂名称(µL)测定管样本10试剂一40试剂二140试剂三10混匀,立即在 470nm 处读取吸光值 A1,1 分钟后读取 A2,△A=A2-A1。【注】:1. 该反应很迅速,加完试剂三即启动反应,所以试剂三加完需立即检测,若 A1 值大于 0.6 或 A2值大于 1.5 或ΔA 大于 1,可降低样本量 V1(如减至 5µL,则试剂二相应增加),则改变后的 V1本试剂盒仅供科研使用2代入公式重新计算。2. 若ΔA 小于 0.005,可增加样本量 V1(如减至 20µL,则试剂二相应减少),或可延长反应时间 T(如延长到 5min 后读取 A2),则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。3. 若上升趋势不稳定,可全部加完稳定几分钟后再读取 A1,选取一段线性增长范围读取 A2。4. 若检测体系不变,可按照样本检测数量,预先把试剂一和二和三按照 40:140:10 比例配成所需体积的混合液,在加样表中直接加一枪 190µL 混合液即可。五、结果计算:1、按样本鲜重计算:酶活定义:每克组织每分钟在反应体系中使 470nm 处吸光值增加 1 为一个酶活单位 U。POD(△OD470 /min/g 鲜重)=ΔA÷(W× V1÷V)÷1÷T =100×ΔA÷W2、按样本蛋白浓度计算:酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 470nm 处吸光值增加 1 为一个酶活单位 U。POD(△OD470 /min/mg prot) =ΔA÷(V1×Cpr)÷1÷T=100×ΔA÷Cpr3、按细胞数量计算:酶活定义:每 104 个细胞每分钟在反应体系中使 470nm 处吸光值 1 为一个酶活单位 U。POD(△OD470 /min/104cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷1÷T=0.2×ΔA4、按液体体积计算:酶活定义:每毫升液体每分钟在反应体系中使 470nm 处吸光值增加 1 为一个酶活单位 U。POD(△OD470 /min/mL)=ΔA÷V1÷1÷T =100×ΔAV---加入提取液体积,1 mL;V1---加入样本体积,0.01mL;T---反应时间,1 min;W---样本质量;Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。
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