使用核糖核酸酶将polyA尾巴从mRNA上切割下来,然后进行oligo dT亲和色谱纯化,LS-MS分析核苷酸信息。(A)基于尿素PAGE的polyA大小分析。变性尿素PAGE电泳mRNA酶切后的60 ng 120 nt和150 nt的polyA尾巴。(B)基于LC-MS 的polyA大小分析。150nt长度的120 p mol polyA分子量的逆卷积质谱结果。(C)期望为150 nt的polyA尾巴长度观测分布。柱状图表明polyA长度的同一性较好。误差线表示3次酶切试验结果的标准偏差。polyA加权平均长度为147 nt。
4. Kozak序列
使用250 pg斑马鱼EGFP IVT mRNA显微注射单细胞期斑马鱼胚胎,注射后6 h筛选EGFP表达效果。荧光图像表明含有经过优化的Kozak序列的mRNA(version 2)在体内表达效果更佳。
IVT mRNA体外转录优化
1. IVT mRNA完整性
图7 完整性良好的长序列IVT mRNA
使用变性凝胶电泳鉴定云舟生物不同批次的IVT mRNA。在不同体外转录条件下均能获得长度>10,000 nt的序列完整的IVT mRNA。
2. 共转录法与酶加法加帽
图8 基于LC-MS的加帽效率分析
(A)共转录法和(B)酶加法均能实现很高的加帽效率。
3. 核苷修饰
图9 修饰的核苷酸增强mRNA表达,同时减少dsRNA产生。
(A)293T细胞中表达萤火虫荧光素酶IVT mRNA。使用的mRNA包括无修饰的、N1-甲基假尿苷修饰的、以及5-甲基胞苷修饰的。修饰的。细胞生长于12孔板,每孔转染1 ug mRNA。293T细胞转染萤光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的萤光素酶活性。误差线表示标准偏差。平均荧光强度使用带颜色的柱状图表示.(B) 等量修饰的和无修饰的EGFP IVT mRNA(每斑点750 ng)经过磁柱纯化,使用斑点杂交估测dsRNA杂质含量。
LNP-mRNA QC数据
云舟生物的LNP-mRNA产品采用优化过后的封装技术,具有良好的均一性、稳定性和递送效率。
1. 冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)结果显示我们封装的LNP-mRNA结构完整且大小均一。
图11 冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)视野下的LNP-mRNA
LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液(pH7.4),冰上解冻后拍摄。比例尺=100 nm。
2. 动态光散射(DLS)分析表明我们的LNP-mRNA可以达到很低的PDI值(PDI<0.1)。云舟生物承诺我们的LNP-mRNA的Zeta电势范围在-10 mV至+10 mV之间。
图12 LNP粒径和Zeta电势分析多分散指数(PDI)
(A)和Zeta电势(B)通过动态光散射(DLS)测定。该方法可以测量粒子运动带来的散射光强度的波动变化。反映的则是样本中的粒子尺寸的异质性。样本中的Zeta电势范围在-1.872到+1.872 mV之间。
LNP-mRNA功能验证
1. LNP-mRNA的体外表达
图13 使用LNP高效递送mRNA
对比使用传统转染试剂,LNP封装的EGFP mRNA表现出更高递送效率。向Jurkat和293T细胞转染1 ug的EGFP mRNA: (A)流式细胞术分析EGFP表达水平。(B)转染后24 h拍摄细胞荧光图片。实验中使用的EGFP mRNA均无核苷修饰。 荧光强度中值表示为MFI。
2. LNP-mRNA 的体内表达
图14 小鼠转导萤光素酶mRNA(Luc mRNA),检测mRNA表达情况和免疫反应。
(A)注射后6 h、24h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。 (B)为量化外源RNA在小鼠中引发的炎症反应,注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。 误差线表示标准偏差。小鼠种系:C57BL/6J;小鼠年龄:8周;注射方法:肌肉注射。(C)向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封装的mRNA,注射后14天,分离Balb/C小鼠的脾脏细胞,针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。
抗体偶联的LNP
通过血管注射LNP时,由于LNP倾向于在肝脏细胞积累,需要人工提升LNP靶向其它组织细胞的效率。 云舟生物已建立抗体偶联的LNP-mRNA生产系统,可制备具有组织特异性的LNP-mRNA。
图15 LNP-mRNA偶联不同的抗体分子影响其生物分布
通过将LNP偶联特定抗体, 在一定剂量下可增强LNP对肺的靶向性。向C57BC/6J 小鼠(6-8周、雌性)尾静脉注射Fluc LNP-mRNA,分离的组织中生物发光表明Fluc的表达。 阴性对照为无LNP封装的普通IVT mRNA,同类对照为IgG2a偶联的Fluc-mRNA。
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