Caspase 3/7活性检测试剂盒

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产品描述：

产品名称：Caspase 3/7活性检测试剂盒

描述:

Caspase 3/7 活性检测试剂盒(Caspase 3/7 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3/7酶活性或纯化的caspase 3/7酶活性的试剂盒。

Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase 3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3和Caspase 7都可以剪切DEVD肽段序列，因此本试剂盒可以检测caspase3/7。

本试剂盒是基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有强吸收。

本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测20个样品(20T)或者100个样品（100T）。

产品组分：

中文别名: CPP32,Yama,apopain,caspase-3,caspase 3

操作说明: 在使用PBS的过程中要特别注意避免溶液被微生物污染。PBS在低温情况下可能会产生沉淀。如果发现有沉淀产生，请置于37℃水浴至完全溶解后再使用。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法: 
1. 准备工作：
a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 测定pNA标准曲线：
a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
b. 把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测，测定A405。
d. 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。
3. 样品的收集：
a. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4ºC离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
b. 对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4ºC离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
c. 对于组织样品：按照每3-10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。
d. 4ºC 16,000-20,000g离心10-15分钟。
e. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
f. 立即测定caspase 3/7的酶活性或-80ºC保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10微升待测样品中至少含有10-30μg蛋白。如果细胞较少，可以适当增加细胞的用量。
4. Caspase 3/7酶活性的检测：
a. 取出适量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上备用。
b. 如下设置反应体系：

储存/保存方法: -20℃保存，Ac-DEVD-pNA和pNA需要避光保存。有效期12个月。

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