动物细胞直接荧光定量PCR逆转录试剂盒(SYBR Green

产品信息

产品名称	产品编号	规格
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit	11172ES40	40 rxns
	11172ES60	100 rxns

 

产品描述 

Hieff^® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行RNA提取（如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等），无需提RNA，可直接进行qPCR表达分析，用时短，操作简单，出错率低，最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。

试剂盒中包含反转录以及荧光检测试剂，无需另外购买，可轻松地进行基因表达分析。

 

产品组分

运输与保存方式

 

FCD Lysis Buffer 和 FCD Washing Buffer融解后置于4℃保存，注意防止污染。FCD Stop Solution、DNase I、4×Hieff^® FCD RT Mix和2×Hieff^® FCD qPCR SYBR Master Mix长期保存时请于-20℃放置。有效期6个月。

 

需自备的试剂及耗材

 

无核酸酶污染的枪头及离心管。

 

注意事项：

 

1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。

2）实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。

3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

 

操作步骤

 

一、裂解产物的制备

1. 将试剂放置于室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免产生气泡。

【注】：没有完全混匀试剂、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。

2. 根据细胞类型，将细胞转移至离心管中，5000 rpm离心2 min收集细胞，充分吸除培养基。若细胞在96孔板中培养，可直接吸除培养基。

3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗细胞，5000 rpm离心2 min，吸尽FCD Washing Buffer。

4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase Ⅰ溶液，室温吸打混匀后静置5分钟，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution, 吸打混匀 5 次左右，即可得到裂解产物。

【注】：a) 细胞数的基本要求是每孔 1 × 10⁴ cells, 该试剂盒可以使用的范围是 1 × 10³ - 1 × 10⁶ cells。若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

b) 50 μL的裂解液对应加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

c) 不同细胞的离心条件不同，请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

d) 细胞裂解产物溶液长期保存时，请置于-20℃。

5. 室温融化4× Hieff^® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分	体积 （μL）	终浓度
4× Hieff® FCD RT Mix	5	1 ×
裂解产物*	x	x
RNase-free H2O	Up to 20	-

*推荐使用量为2-5 μL，尽量不超过45%。

二、反转录

移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行反转录反应：

反应温度	反应时间
55℃ 85℃	15 min 5 min

【注】：反转录温度推荐使用55℃，对于高GC含量模板或者复杂模板，可将反转录温度提高到 60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，得到合适的Ct值（10-35），可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。

三、荧光定量PCR

a. 体系配置

推荐使用下列组份比例配制反应液（配制过程请于冰上进行）:

组分	体积（μL）	终浓度
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix	10	1 ×
Forward Primer (10 μM)	0.4	200 nM
Reverse Primer (10 μM)	0.4	200 nM
反转录产物	X	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

【注】：反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增，适当稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL，尽量不要超过6 μL。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

建议采用下面的 Shuttle PCR 标准操作流程进行 PCR 反应。必要时进行 PCR 反应条件的优化。使用Tm值较低的引物等进行Shuttle PCR难以扩增时，进行三步法 PCR 扩增反应。

 

b. 荧光定量PCR扩增程序（两步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30 sec	1
变性	95℃	10 sec	35-40
退火/延伸	60℃	30 sec
熔解曲线阶段                仪器默认设置                                         1

实验条件允许时，也可使用快速程序进行扩增。

c. 荧光定量PCR快速扩增程序（两步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 sec	1
变性	95℃	5 sec	40
退火/延伸	60℃	10 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

【注】：退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

d. 荧光定量PCR扩增程序（三步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30 s	1
变性	95℃	10 sec	40
退火	55-60℃	20 sec
延伸	72℃	20 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

  

HB220801