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Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit
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有效期1年
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
-20℃保存
40 rxns
产品信息
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit |
11172ES40 |
40 rxns |
11172ES60 |
100 rxns |
产品描述
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行RNA提取(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。
试剂盒中包含反转录以及荧光检测试剂,无需另外购买,可轻松地进行基因表达分析。
产品组分
运输与保存方式
FCD Lysis Buffer 和 FCD Washing Buffer融解后置于4℃保存,注意防止污染。FCD Stop Solution、DNase I、4×Hieff® FCD RT Mix和2×Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix长期保存时请于-20℃放置。有效期6个月。
需自备的试剂及耗材
无核酸酶污染的枪头及离心管。
注意事项:
1)使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
2)实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
3)本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
5)本产品仅作科研用途!
操作步骤
一、裂解产物的制备
1. 将试剂放置于室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免产生气泡。
【注】:没有完全混匀试剂、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
2. 根据细胞类型,将细胞转移至离心管中,5000 rpm离心2 min收集细胞,充分吸除培养基。若细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase Ⅰ溶液,室温吸打混匀后静置5分钟,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution, 吸打混匀 5 次左右,即可得到裂解产物。
【注】:a) 细胞数的基本要求是每孔 1 × 104 cells, 该试剂盒可以使用的范围是 1 × 103 - 1 × 106 cells。若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
b) 50 μL的裂解液对应加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。
c) 不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。
d) 细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-20℃。
5. 室温融化4× Hieff® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:
组分 |
体积 (μL) |
终浓度 |
4× Hieff® FCD RT Mix |
5 |
1 × |
裂解产物* |
x |
x |
RNase-free H2O |
Up to 20 |
- |
*推荐使用量为2-5 μL,尽量不超过45%。
二、反转录
移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应:
反应温度 |
反应时间 |
55℃ 85℃ |
15 min 5 min |
【注】:反转录温度推荐使用55℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到 60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-20℃保存。
三、荧光定量PCR
a. 体系配置
推荐使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):
组分 |
体积(μL) |
终浓度 |
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix |
10 |
1 × |
Forward Primer (10 μM) |
0.4 |
200 nM |
Reverse Primer (10 μM) |
0.4 |
200 nM |
反转录产物 |
X |
- |
RNase-free H2O |
Up to 20 |
- |
【注】:反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增,适当稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL,尽量不要超过6 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
建议采用下面的 Shuttle PCR 标准操作流程进行 PCR 反应。必要时进行 PCR 反应条件的优化。使用Tm值较低的引物等进行Shuttle PCR难以扩增时,进行三步法 PCR 扩增反应。
b. 荧光定量PCR扩增程序(两步法)
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
变性 |
95℃ |
10 sec |
35-40 |
退火/延伸 |
30 sec |
||
熔解曲线阶段 仪器默认设置 1 |
实验条件允许时,也可使用快速程序进行扩增。
c. 荧光定量PCR快速扩增程序(两步法)
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
变性 |
95℃ |
5 sec |
40 |
退火/延伸 |
60℃ |
10 sec |
|
熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 |
1 |
【注】:退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。
d. 荧光定量PCR扩增程序(三步法)
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
30 s |
1 |
变性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
退火 |
55-60℃ |
20 sec |
|
延伸 |
72℃ |
20 sec |
|
熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 |
1 |
HB220801
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