沉淀法质粒大提试剂盒(沉淀法)
储存条件:常温保存,保质期 1 年。RNase A 溶液 4 ℃保存。
产品简介:
本试剂盒采用独特的缓冲系统,结合传统的异丙醇沉淀方法,可快速地获得大量高纯度的质粒 DNA。
使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。
产品内容:
注意事项:
a.裂解液 II 如有沉淀,37 ℃水浴溶解后使用。
b.裂解液 II 含 NaOH,使用后请及时拧紧瓶盖,防止变质。
c.RNase A 溶液,4 ℃保存 6 个月有效,-20℃可长期保存。
d.第一次使用时,将试剂盒所带的 RNase A 加入悬浮液 I 中,之后置于 4 ℃保存。
e.纯化液 III 请置于 4 ℃冰箱预冷
操作步骤:
细胞裂解
1. 离心收集 50-200 mL 过夜培养的细菌,室温 10,000 rmp 离心 5min(或 5,000 rmp 离心 10 min)。
2. 向菌体沉淀中加入 10 mL 悬浮液 I,使用移液器吹打沉淀彻底混匀,静置 3-5 min。
3. 向上述混合液中加入 10 mL 裂解液 II,立即温和上下颠倒离心管 6-8 次,室温静置 5-10 min 左右至混合液变清亮,请勿静置过长时间。
注意:为避免基因组 DNA 污染和质粒断裂,请勿剧烈震荡离心管,请勿静置超过 10 min。
4. 加入 10 mL 预冷的纯化液 III,立即温和上下颠倒离心管 6-8 次,冰上静置 10 min。4 ℃ 10,000 rpm 离心 15 min(或 5,000 rmp 离心 30 min)。
质粒 DNA 纯化
1. 将上述离心后的上清液用推杆型过滤柱过滤,并转移到新的 50 mL 离心管中。
2. 在过滤后的上清中加入 20 mL 异丙醇,上下颠倒充分混匀,室温放置 10 min。
3. 4 ℃ 10,000 rpm 离心 15 min(或 5,000 rmp 离心 30 min)。小心倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀)并倒置在吸水纸上。
4. 在室温下用 5 mL 70%乙醇涮洗管壁,10,000 rpm 离心 5 min,小心倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀,如果白色沉淀脱落,可以再次离心),倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体。
5. 用 0.5-1.5 mL TE 溶解 DNA 沉淀,琼脂糖凝胶电泳检测。长期保存请置于-20 ℃。
质粒 DNA 浓度及纯度检测:
得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为多条带,这些条带是质粒的多聚体造成的,不影响后续的酶切、转染等实验。OD260值为 1 相当于大约 50 μg/mL 双链DNA。
纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在 1.8-2.0 左右,可直接应用于分子生物学等常规操作。如果溶解时不使用缓冲液,而使用 ddH2O,比值会偏低,但并不表示纯度低,因为 pH 值和离子存在会影响光吸收值。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!