去内毒素质粒大提试剂盒(沉淀法)
储存条件:常温保存,保质期 1 年,RNase A 溶液和内毒素清除剂 2-8℃保存,保质期 1 年。
产品简介:
本试剂盒采用独特的缓冲系统,结合传统的异丙醇沉淀方法,可快速地获得大量高纯度的质粒 DNA。
使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。
产品内容:
性,同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。
注意事项:
a. 裂解液 II 如有沉淀,37 ℃水浴溶解后使用。
b. 裂解液 II 含 NaOH,使用后请及时拧紧瓶盖,防止变质。
c. 需自备异丙醇、70%乙醇和 50 mL 离心管。
d. RNase A 和内毒素清除剂,4 ℃保存 12 个月有效,-20 ℃可长期保存。
e. 第一次使用时,将试剂盒所带的 RNase A 加入悬浮液 I 中,之后置于 4 ℃保存。
f. 纯化液 III 请置于 4 ℃冰箱预冷。
g. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10 kb 的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加 I、II、III 的用量;TE 推荐在 65-70℃水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间,以提高提取效率。
操作步骤:
细胞裂解
1. 离心收集 50-200 mL 过夜培养的细菌(高拷贝质粒建议 50-100 mL,低拷贝质粒建议 100-200 mL),室温 10,000 rmp 离心 5min(或 5,000 rmp 离心 10 min)。
2. 向菌体沉淀中加入 10 mL 悬浮液 I(已加入 RNase A),使用移液器吹打沉淀彻底混匀,静置 3-5 min。
3. 向上述混合液中加入 10 mL 裂解液 II,立即温和上下颠倒离心管 6-8 次,室温静置 5-10 min 左右至混合液变清亮,请勿静置过长时间。
注意:为避免基因组 DNA 污染和质粒断裂,切勿剧烈震荡离心管,请勿静置超过 10 min。加入裂解液 II后会变半透明粘稠状。
4. 加入 10 mL 预冷的纯化液 III,立即温和上下颠倒离心管 6-8 次,冰上静置 10 min。4 ℃ 10,000 rpm 离心 15 min(或 5,000 rmp 离心 30 min)。
质粒 DNA 纯化
1. 将上述离心后的上清液用针头过滤器过滤到新的 50 mL 离心管中。
2. 在过滤后的上清中加入 18 mL 异丙醇,上下颠倒充分混匀,室温放置 10 min。
3. 4 ℃ 10,000 rpm 离心 15 min(或 5,000 rmp 离心 30 min)。小心倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀)并倒置在吸水纸上。
4. 在室温下用 5 mL 70%乙醇涮洗管壁,10,000 rpm 离心 5 min,小心倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀,如果白色沉淀脱落,可以再次离心),倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体。
质粒 DNA 内毒素去除(此步骤可以重复 1-2 次)
1. 在上述沉淀中加入 1.5 mL(体积可适当减少,后续内毒素清除剂的量按比例减少)的 TE 完全溶解沉淀,转移到两个 1.5 mL 离心管中,每管 750 μL。
2. 每管加入 75 μL 内毒素清除剂 A(1/10 体积),充分混匀,冰浴 5 min。
3. 每管再加入 75 μL 内毒素清除剂 B(1/10 体积),充分混匀,冰浴 10 min(此时溶液为透明红色)。
4. 将离心管颠倒混匀后置于 60 ℃水浴 5 min(此时溶液变浑浊)。
5. 室温 12,000 rpm 离心 5 min 分相(室温需高于 20 ℃,否则内毒素清除剂无法分相),小心吸取上清(下层为红色,上清为无色)于新的离心管中(如未分相,请重复 60 ℃水浴后再离心)。
质粒 DNA 回收
1. 在上步所得上清中加入等体积的异丙醇(约 750 μL),颠倒混匀,4 ℃ 12,000 rpm 离心 5 min。轻轻倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀)。
2. 加入 1 mL 70%乙醇涮洗管壁,12,000 rpm 离心 5 min,小心吸弃上清,室温晾干。
3. 加入适量的水或者 TE 溶解沉淀。
质粒 DNA 浓度及纯度检测
1. 得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为多条带,这些条带是质粒的多聚体造成的,不影响后续的酶切、转染等实验。OD260值为 1 相当于大约 50 μg/mL 双链 DNA。
2. 纯化的质粒 DNA OD260/OD280通常在 1.8-2.0 左右,可直接应用于分子生物学等常规操作。如果溶解时不使用缓冲液,而使用 ddH2O,比值会偏低,但并不表示纯度低,因为 pH 值和离子存在会影响光吸收值。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!