总抗氧化能力ABTS法测试盒

 
总抗氧化能力ABTS法测试盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

测定原理：
ABTS 法是使用广泛的间接检测方法，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基 ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介质中，在 734nm 处有大吸收。被测物质加入 ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能与 ABTS+发生反应而使反应体系褪色。在 734nm 检测吸光度的变化，并以 Trolox 作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。

自备实验用品：
恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 24mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×2 瓶，4℃避光保存。

样品的制备：
(1)血清、血浆、唾液或尿液等液体样品
血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用 EDTA  抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30d）后再测定。
(2) 组织样品
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
(3) 细胞样品
按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。



操作步骤：
1、 酶标仪预热 30min，调节波长至 734nm。
2、 工作液的配置：临用前取试剂二一瓶，加入 11mL 试剂一，震荡混匀 20min 后，静置，取上清使用。（注意，现配现用）
3、操作表（在 EP 管中反应）      

	空白管	测定管
提取液（μL）	10
样品（μL）		10
工作液（μL）	190	190

 充分混匀，10min 内测定 734nm 吸光值，△A= A 空白-A 测定
注意：空白管只需测定一次，吸取工作液时不要吸到底部沉淀，若 A 测定小于 0.4，需用提取液稀释后检测。

总抗氧化能力计算公式：
1、以自由基清除率表示：
ABTS 自由基清除率（％）=（A 空白-A 测定）÷A 空白×100％
2、以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量表示：
标准曲线：y = 0.7021x - 0.0012    R2 = 0.9985    x:Trolox 浓度(μmol/mL)
y:吸光值差值△A
单位定义:以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量来表示样本的 ABTS 自由基清除能力。（1）按样本质量计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/g 鲜重）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 样÷(V 样÷V 样总×W) =1.424×（△A+0.0012）÷W
（2）按样本蛋白浓度计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/mg prot）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 样÷(V 样÷V 样总×Cpr) =1.424×（△A+0.0012）÷Cpr
(3)按细胞计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/104cell）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 样÷（V 样÷V 样总×细胞
数量（万个））= 1.424×（△A+0.0012）÷ 细胞数量（万个）
（3）按液体体积计算
总抗氧化能力（μmol Trolox/mL）=（△A+0.0012）÷0.7021 =1.424×（△A+0.0012）
V样总：加入提取液体积，1 mL；V 样：反应中样品体积，10μL；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL

注意事项：
1.尽量避免使用在中碱性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
2.样品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢剂和 DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。