谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶GOT/AST测试盒

 
谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶GOT/AST测试盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
GOT（ 2.6.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化可逆转氨基反应，是氨基酸代谢的重要酶。此外，GOT在心肌细胞中含量，临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。肝脏损害时其血清浓度也可升高。

测定原理：
GOT催化 α-同戊二酸和天门冬氨酸发生转氨基反应，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙tong酸；丙tong酸可与2,4-二硝基ben肼反应生成2,4-二硝ji苯腙，在碱性条件下显棕红色；测定505nm吸光度的变化，即可计算GOT酶活力。

需自备的仪器和用品：
可见分光光计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。



试剂的组成和配制：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体2.5 mL×1瓶， 4℃保存； 
试剂二：液体2.5 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂三：液体25 mL×1瓶，4℃保存；

样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

测定操作表：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。
2、在EP管或在96孔板中加入下列试剂

试剂名称（μL）	测定管	对照管
待测样本	10
煮沸10min的待测样本		10
试剂一	25
蒸馏水		25

混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min

试剂二

25

25

混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min

试剂三

240

240

混匀，室温（25℃）放置10min，505nm波长处测各管吸光度A。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶GOT/AST测试盒
计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.4768x-0.0013   (x为标准品浓度，umol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）GOT活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/mL）=（ΔA+0.0013）÷0.4768÷T×103=104.9×（ΔA+0.0013）
3、细胞、细菌和组织中GOT活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA+0.0013）÷0.4786×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =104.9×（ΔA+0.0013）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA+0.0013）÷0.4768×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =104.9×（ΔA+0.0013）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/104 cell）=[（ΔA+0.0013）÷0.4768×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.21×（ΔA+0.0013）
V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，20min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；103：1umol/mL=103 nmol/mL。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.2384x-0.0013   (x为标准品浓度，umol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）GOT活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/mL）=（ΔA+0.0013）÷0.2384÷T×103=209.7×（ΔA+0.0013）
3、细胞、细菌和组织中GOT活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =209.7×（ΔA+0.0013）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =209.7×（ΔA+0.0013）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙tong酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/104 cell）= [（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.419×（ΔA+0.0013）
V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，20 min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；103：1umol/mL=103 nmol/mL。
1、标准曲线线性范围为：0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、ΔA线性范围为：0.01 -1。