过氧化氢含量H2O2试剂盒

过氧化氢含量H2O2试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
H2O2是生物体内常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H2O2不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H2O2也是许多氧化应急反应中的关键调节因子，。

测定原理：
H2O2与硫酸钛生成的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、丙tong60mL、浓盐酸10mL、研钵和冰。



试剂的组成和配制：
试剂一：丙tong60mL×1瓶，4℃保存；（自备）
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂4℃保存；(溶解时间较长，约30min，可40℃-60℃加热溶解，务必提前准备)
试剂三：15mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：60mL×1瓶，4℃保存；

H2O2提取： 
1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；用试剂一定容至1mL；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 组织样品的制备：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆；转移至EP管中，用试剂一定容至1mL，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至415nm，蒸馏水调零。
2、将试剂二、三和四37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
3、在EP管中按顺序加入下列试剂

试剂名称（μL）	测定管	对照管
样本	吸取的量的为全部上清液
试剂一		1000
试剂二	100	100
试剂三	200	200

4000g，25℃离心10min，弃上清，留沉淀

试剂四

1000

1000

加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，倒入比色皿中，测定415nm处吸光值A。对照管只要做一次即可。计算ΔA＝A测定-A对照。

注意事项：
1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。
2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。

过氧化氢含量H2O2试剂盒
H2O2含量计算：
1、标准条件下测定的回归曲线，y = 0.7488x + 0.0006 (x为标准品浓度，μmol/mL；y为ΔA)。
2、血清（浆）中H2O2含量的计算：
H2O2含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)
3、细菌、细胞或组织中H2O2含量计算
（1）按照蛋白浓度计算
H2O2含量(μmol/mg prot)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样本质量计算
H2O2含量(μmol/g鲜重)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W
 (3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
H2O2含量(μmol/104)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)
V1：加入反应体系中样本体积，1mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
注意：标曲线性范围为0.1μmol/mL到2μmol/mL，吸光度ΔA线性范围为0.07-1.5，若ΔA超过1.5则需要稀释，计算公式乘以相应稀释倍数。