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- 2025年07月13日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pPIC9
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
别名：pPIC9毕赤酵母质粒
别称: pPIC9
质粒属性
质粒简介
pPIC9是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体。1.pPIC9载体大小8,023 bp，是融合表达载体。2.载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为Xho I, SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I. 3.利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。4.在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。5.毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。6.为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用SacI限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型) 7..为了将基因插入GS115或KM71的His4区, 使用Sal I或者Stu I限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+ Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型) 8.将基因插入GS115的AOX1区域，需要使用Bgl II线性化质粒 (产生His+MutS基因型)。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 8023 bp ds-DNA circular SYN 09-SEP-2016
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled 2
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 8023)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Friday, September 9, 2016 from SnapGene Viewer 3.1.4
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..8023
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
promoter 2..937
/gene="Pichia pastoris AOX1"
/note="AOX1 promoter"
/note="inducible promoter, regulated by methanol"
CDS 949..1215
/codon_start=1
/gene="MF-alpha-1"
/product="N-terminal secretion signal from S. cerevisiae
alpha-factor"
/note="alpha-factor secretion signal"
/note="Cleavage by the Kex2 protease occurs after the
dibasic KR sequence. The EA dipeptides are then removed by
dipeptidyl aminopeptidase A."
/translation="MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE
GDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA"
terminator 1321..1567
/gene="Pichia pastoris AOX1"
/note="AOX1 terminator"
/note="transcription terminator for AOX1"
CDS complement(1980..4514)
/codon_start=1
/gene="Pichia pastoris HIS4"
/product="multifunctional enzyme, required for histidine
biosynthesis"
/note="PpHIS4"
/note="auxotrophic marker for Pichia pastoris"
/translation="MTFPLLPAYASVAEFDNSLSLVGKAVFPYAADQLHNLIKFTQSTE
LQVNVQVESSVTEDQFEELIDNLLKLYNNGINEVILDLDLAERVVQRMIPGARVIYRTL
VDKVASLPANASIAVPFSSPLGDLKSFTNGGSRTVYAFSETAKLVDVTSTVASGIIPII
DARQLTTEYELSEDVKKFPVSEILLASLTTDRPDGLFTTLVADSSNYSLGLVYSSKKSI
PEAIRTQTGVYQSRRHGLWYKGATSGATQKLLGIELDCDGDCLKFVVEQTGVGFCHLER
TSCFGQSKGLRAMEATLWDRKSNAPEGSYTKRLFDDEVLLNAKIREEADELAEAKSKED
IAWECADLFYFALVRCAKYGVTLDEVERNLDMKSLKVTRRKGDAKPGYTKEQPKEESKP
KEVPSEGRIELCKIDVSKASSQEIEDALRRPIQKTEQIMELVKPIVDNVRQNGDKALLE
LTAKFDGVALKTPVLEAPFPEELMQLPDNVKRAIDLSIDNVRKFHEAQLTETLQVETC-P
GVVCSRFARPIEKVGLYIPGGTAILPSTSLMLGVPAKVAGCKEIVFASPPKKDGTLTPE
VIYVAHKVGAKCIVLAGGAQAVAAMAYGTETVPKCDKIFGPGNQFVTAAKMMVQNDTSA
LCSIDMPAGPSEVLVIADKYADPDFVASDLLSQAEHGIDSQVILLAVDMTDKELARIED
AVHNQAVQLPRVEIVRKCIAHSTTLSVATYEQALEMSNQYAPEHLILQIENASSYVDQV
QHAGSVFVGAYSPESCGDYSSGTNHTLPTYGYARQYSGVNTATFQKFITSQDVTPEGLK
HIGQAVMDLAAVEGLDAHRNAVKVRMEKLGLI"
misc_feature 4869..5625
/note="AOX1 3' fragment"
/note="region downstream of Pichia pastoris AOX1 gene"
misc_feature 5768..5908
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
rep_origin complement(6094..6682)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(6853..7713)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(7714..7818)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag
61 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt
121 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc
181 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta
241 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta
301 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg
361 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct
421 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg
481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt
541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct
601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct
661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact
721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat
781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt
841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga
901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct
961 tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact
1021 acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta
1081 gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg
1141 tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa
1201 agagaggctg aagcttacgt agaattccct agggcggccg cgaattaatt cgccttagac
1261 atgactgttc ctcagttcaa gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa
1321 tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt
1381 ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc
1441 ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa
1501 tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta
1561 agtgagaagt tcgtttgtgc aagcttatcg ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt
1621 taaattgcta acgcagtcag gcaccgtgta tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc
1681 tcggcaccgt caccctggat gctgtaggca taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc
1741 tcttgcggga tatcgtccat tccgacagca tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc
1801 tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcgcac ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg
1861 gccgccgccc agtcctgctc gcttcgctac ttggagccac tatcgactac gcgatcatgg
1921 cgaccacacc cgtcctgtgg atctatcgaa tctaaatgta agttaaaatc tctaaataat
1981 taaataagtc ccagtttctc catacgaacc ttaacagcat tgcggtgagc atctagacct
2041 tcaacagcag ccagatccat cactgcttgg ccaatatgtt tcagtccctc aggagttacg
2101 tcttgtgaag tgatgaactt ctggaaggtt gcagtgttaa ctccgctgta ttgacgggca
2161 tatccgtacg ttggcaaagt gtggttggta ccggaggagt aatctccaca actctctgga
2221 gagtaggcac caacaaacac agatccagcg tgttgtactt gatcaacata agaagaagca
2281 ttctcgattt gcaggatcaa gtgttcagga gcgtactgat tggacatttc caaagcctgc
2341 tcgtaggttg caaccgatag ggttgtagag tgtgcaatac acttgcgtac aatttcaacc
2401 cttggcaact gcacagcttg gttgtgaaca gcatcttcaa ttctggcaag ctccttgtct
2461 gtcatatcga cagccaacag aatcacctgg gaatcaatac catgttcagc ttgagacaga
2521 aggtctgagg caacgaaatc tggatcagcg tatttatcag caataactag aacttcagaa
2581 ggcccagcag gcatgtcaat actacacagg gctgatgtgt cattttgaac catcatcttg
2641 gcagcagtaa cgaactggtt tcctggacca aatattttgt cacacttagg aacagtttct
2701 gttccgtaag ccatagcagc tactgcctgg gcgcctcctg ctagcacgat acacttagca
2761 ccaaccttgt gggcaacgta gatgacttct ggggtaaggg taccatcctt cttaggtgga
2821 gatgcaaaaa caatttcttt gcaaccagca actttggcag gaacacccag catcagggaa
2881 gtggaaggca gaattgcggt tccaccagga atatagaggc caactttctc aataggtctt
2941 gcaaaacgag agcagactac accagggcaa gtctcaactt gcaacgtctc cgttagttga
3001 gcttcatgga atttcctgac gttatctata gagagatcaa tggctctctt aacgttatct
3061 ggcaattgca taagttcctc tgggaaagga gcttctaaca caggtgtctt caaagcgact
3121 ccatcaaact tggcagttag ttctaaaagg gctttgtcac cattttgacg aacattgtcg
3181 acaattggtt tgactaattc cataatctgt tccgttttct ggataggacg acgaagggca
3241 tcttcaattt cttgtgagga ggccttagaa acgtcaattt tgcacaattc aatacgacct
3301 tcagaaggga cttctttagg tttggattct tctttaggtt gttccttggt gtatcctggc
3361 ttggcatctc ctttccttct agtgaccttt agggacttca tatccaggtt tctctccacc
3421 tcgtccaacg tcacaccgta cttggcacat ctaactaatg caaaataaaa taagtcagca
3481 cattcccagg ctatatcttc cttggattta gcttctgcaa gttcatcagc ttcctcccta
3541 attttagcgt tcaacaaaac ttcgtcgtca aataaccgtt tggtataaga accttctgga
3601 gcattgctct tacgatccca caaggtggct tccatggctc taagaccctt tgattggcca
3661 aaacaggaag tgcgttccaa gtgacagaaa ccaacacctg tttgttcaac cacaaatttc
3721 aagcagtctc catcacaatc caattcgata cccagcaact tttgagttgc tccagatgta
3781 gcacctttat accacaaacc gtgacgacga gattggtaga ctccagtttg tgtccttata
3841 gcctccggaa tagacttttt ggacgagtac accaggccca acgagtaatt agaagagtca
3901 gccaccaaag tagtgaatag accatcgggg cggtcagtag tcaaagacgc caacaaaatt
3961 tcactgacag ggaacttttt gacatcttca gaaagttcgt attcagtagt caattgccga
4021 gcatcaataa tggggattat accagaagca acagtggaag tcacatctac caactttgcg
4081 gtctcagaaa aagcataaac agttctacta ccgccattag tgaaactttt caaatcgccc
4141 agtggagaag aaaaaggcac agcgatacta gcattagcgg gcaaggatgc aactttatca
4201 accagggtcc tatagataac cctagcgcct gggatcatcc tttggacaac tctttctgcc
4261 aaatctaggt ccaaaatcac ttcattgata ccattattgt acaacttgag caagttgtcg
4321 atcagctcct caaattggtc ctctgtaacg gatgactcaa cttgcacatt aacttgaagc
4381 tcagtcgatt gagtgaactt gatcaggttg tgcagctggt cagcagcata gggaaacacg
4441 gcttttccta ccaaactcaa ggaattatca aactctgcaa cacttgcgta tgcaggtagc
4501 aagggaaatg tcatacttga agtcggacag tgagtgtagt cttgagaaat tctgaagccg
4561 tatttttatt atcagtgagt cagtcatcag gagatcctct acgccggacg catcgtggcc
4621 ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg
4681 gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca
4741 ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg
4801 gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag
4861 ggagagcgtc gagtatctat gattggaagt atgggaatgg tgatacccgc attcttcagt
4921 gtcttgaggt ctcctatcag attatgccca actaaagcaa ccggaggagg agatttcatg
4981 gtaaatttct ctgacttttg gtcatcagta gactcgaact gtgagactat ctcggttatg
5041 acagcagaaa tgtccttctt ggagacagta aatgaagtcc caccaataaa gaaatccttg
5101 ttatcaggaa caaacttctt gtttcgaact ttttcggtgc cttgaactat aaaatgtaga
5161 gtggatatgt cgggtaggaa tggagcgggc aaatgcttac cttctggacc ttcaagaggt
5221 atgtagggtt tgtagatact gatgccaact tcagtgacaa cgttgctatt tcgttcaaac
5281 cattccgaat ccagagaaat caaagttgtt tgtctactat tgatccaagc cagtgcggtc
5341 ttgaaactga caatagtgtg ctcgtgtttt gaggtcatct ttgtatgaat aaatctagtc
5401 tttgatctaa ataatcttga cgagccaagg cgataaatac ccaaatctaa aactctttta
5461 aaacgttaaa aggacaagta tgtctgcctg tattaaaccc caaatcagct cgtagtctga
5521 tcctcatcaa cttgaggggc actatcttgt tttagagaaa tttgcggaga tgcgatatcg
5581 agaaaaaggt acgctgattt taaacgtgaa atttatctca agatctctgc ctcgcgcgtt
5641 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc
5701 tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt
5761 gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta
5821 tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag
5881 atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct
5941 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt
6001 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc
6061 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga
6121 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata
6181 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac
6241 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg
6301 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc
6361 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag
6421 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt
6481 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt
6541 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg
6601 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac
6661 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca
6721 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac
6781 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac
6841 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt
6901 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt
6961 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt
7021 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc
7081 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa
7141 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg
7201 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt
7261 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc
7321 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt
7381 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg
7441 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac
7501 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc
7561 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt
7621 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg
7681 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag
7741 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa
7801 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat
7861 tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga
7921 attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gataagctga ctcatgttgg tattgtgaaa
7981 tagacgcaga tcgggaacac tgaaaaataa cagttattat tcg
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
别名：pPIC9毕赤酵母质粒
别称: pPIC9
| 启动子: | AOX1 |
|---|---|
| 复制子: | pBR322 |
| 质粒分类: | 酵母系列，毕赤酵母表达载体 |
| 质粒大小: | 8023bp |
| 原核抗性: | Amp |
| 筛选标记: | HIS4 |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | 酵母细胞 |
| 5'测序引物: | AOX5:GACTGGTTCCAATTGACAAGC |
| 3'测序引物: | AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT |
质粒属性
| 载体宿主： | 酵母菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 筛选标记： | |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
pPIC9是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体。1.pPIC9载体大小8,023 bp，是融合表达载体。2.载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为Xho I, SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I. 3.利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。4.在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。5.毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。6.为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用SacI限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型) 7..为了将基因插入GS115或KM71的His4区, 使用Sal I或者Stu I限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+ Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型) 8.将基因插入GS115的AOX1区域，需要使用Bgl II线性化质粒 (产生His+MutS基因型)。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 8023 bp ds-DNA circular SYN 09-SEP-2016
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled 2
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 8023)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Friday, September 9, 2016 from SnapGene Viewer 3.1.4
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..8023
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
promoter 2..937
/gene="Pichia pastoris AOX1"
/note="AOX1 promoter"
/note="inducible promoter, regulated by methanol"
CDS 949..1215
/codon_start=1
/gene="MF-alpha-1"
/product="N-terminal secretion signal from S. cerevisiae
alpha-factor"
/note="alpha-factor secretion signal"
/note="Cleavage by the Kex2 protease occurs after the
dibasic KR sequence. The EA dipeptides are then removed by
dipeptidyl aminopeptidase A."
/translation="MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE
GDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA"
terminator 1321..1567
/gene="Pichia pastoris AOX1"
/note="AOX1 terminator"
/note="transcription terminator for AOX1"
CDS complement(1980..4514)
/codon_start=1
/gene="Pichia pastoris HIS4"
/product="multifunctional enzyme, required for histidine
biosynthesis"
/note="PpHIS4"
/note="auxotrophic marker for Pichia pastoris"
/translation="MTFPLLPAYASVAEFDNSLSLVGKAVFPYAADQLHNLIKFTQSTE
LQVNVQVESSVTEDQFEELIDNLLKLYNNGINEVILDLDLAERVVQRMIPGARVIYRTL
VDKVASLPANASIAVPFSSPLGDLKSFTNGGSRTVYAFSETAKLVDVTSTVASGIIPII
DARQLTTEYELSEDVKKFPVSEILLASLTTDRPDGLFTTLVADSSNYSLGLVYSSKKSI
PEAIRTQTGVYQSRRHGLWYKGATSGATQKLLGIELDCDGDCLKFVVEQTGVGFCHLER
TSCFGQSKGLRAMEATLWDRKSNAPEGSYTKRLFDDEVLLNAKIREEADELAEAKSKED
IAWECADLFYFALVRCAKYGVTLDEVERNLDMKSLKVTRRKGDAKPGYTKEQPKEESKP
KEVPSEGRIELCKIDVSKASSQEIEDALRRPIQKTEQIMELVKPIVDNVRQNGDKALLE
LTAKFDGVALKTPVLEAPFPEELMQLPDNVKRAIDLSIDNVRKFHEAQLTETLQVETC-P
GVVCSRFARPIEKVGLYIPGGTAILPSTSLMLGVPAKVAGCKEIVFASPPKKDGTLTPE
VIYVAHKVGAKCIVLAGGAQAVAAMAYGTETVPKCDKIFGPGNQFVTAAKMMVQNDTSA
LCSIDMPAGPSEVLVIADKYADPDFVASDLLSQAEHGIDSQVILLAVDMTDKELARIED
AVHNQAVQLPRVEIVRKCIAHSTTLSVATYEQALEMSNQYAPEHLILQIENASSYVDQV
QHAGSVFVGAYSPESCGDYSSGTNHTLPTYGYARQYSGVNTATFQKFITSQDVTPEGLK
HIGQAVMDLAAVEGLDAHRNAVKVRMEKLGLI"
misc_feature 4869..5625
/note="AOX1 3' fragment"
/note="region downstream of Pichia pastoris AOX1 gene"
misc_feature 5768..5908
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
rep_origin complement(6094..6682)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(6853..7713)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(7714..7818)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag
61 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt
121 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc
181 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta
241 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta
301 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg
361 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct
421 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg
481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt
541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct
601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct
661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact
721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat
781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt
841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga
901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct
961 tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact
1021 acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta
1081 gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg
1141 tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa
1201 agagaggctg aagcttacgt agaattccct agggcggccg cgaattaatt cgccttagac
1261 atgactgttc ctcagttcaa gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa
1321 tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt
1381 ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc
1441 ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa
1501 tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta
1561 agtgagaagt tcgtttgtgc aagcttatcg ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt
1621 taaattgcta acgcagtcag gcaccgtgta tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc
1681 tcggcaccgt caccctggat gctgtaggca taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc
1741 tcttgcggga tatcgtccat tccgacagca tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc
1801 tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcgcac ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg
1861 gccgccgccc agtcctgctc gcttcgctac ttggagccac tatcgactac gcgatcatgg
1921 cgaccacacc cgtcctgtgg atctatcgaa tctaaatgta agttaaaatc tctaaataat
1981 taaataagtc ccagtttctc catacgaacc ttaacagcat tgcggtgagc atctagacct
2041 tcaacagcag ccagatccat cactgcttgg ccaatatgtt tcagtccctc aggagttacg
2101 tcttgtgaag tgatgaactt ctggaaggtt gcagtgttaa ctccgctgta ttgacgggca
2161 tatccgtacg ttggcaaagt gtggttggta ccggaggagt aatctccaca actctctgga
2221 gagtaggcac caacaaacac agatccagcg tgttgtactt gatcaacata agaagaagca
2281 ttctcgattt gcaggatcaa gtgttcagga gcgtactgat tggacatttc caaagcctgc
2341 tcgtaggttg caaccgatag ggttgtagag tgtgcaatac acttgcgtac aatttcaacc
2401 cttggcaact gcacagcttg gttgtgaaca gcatcttcaa ttctggcaag ctccttgtct
2461 gtcatatcga cagccaacag aatcacctgg gaatcaatac catgttcagc ttgagacaga
2521 aggtctgagg caacgaaatc tggatcagcg tatttatcag caataactag aacttcagaa
2581 ggcccagcag gcatgtcaat actacacagg gctgatgtgt cattttgaac catcatcttg
2641 gcagcagtaa cgaactggtt tcctggacca aatattttgt cacacttagg aacagtttct
2701 gttccgtaag ccatagcagc tactgcctgg gcgcctcctg ctagcacgat acacttagca
2761 ccaaccttgt gggcaacgta gatgacttct ggggtaaggg taccatcctt cttaggtgga
2821 gatgcaaaaa caatttcttt gcaaccagca actttggcag gaacacccag catcagggaa
2881 gtggaaggca gaattgcggt tccaccagga atatagaggc caactttctc aataggtctt
2941 gcaaaacgag agcagactac accagggcaa gtctcaactt gcaacgtctc cgttagttga
3001 gcttcatgga atttcctgac gttatctata gagagatcaa tggctctctt aacgttatct
3061 ggcaattgca taagttcctc tgggaaagga gcttctaaca caggtgtctt caaagcgact
3121 ccatcaaact tggcagttag ttctaaaagg gctttgtcac cattttgacg aacattgtcg
3181 acaattggtt tgactaattc cataatctgt tccgttttct ggataggacg acgaagggca
3241 tcttcaattt cttgtgagga ggccttagaa acgtcaattt tgcacaattc aatacgacct
3301 tcagaaggga cttctttagg tttggattct tctttaggtt gttccttggt gtatcctggc
3361 ttggcatctc ctttccttct agtgaccttt agggacttca tatccaggtt tctctccacc
3421 tcgtccaacg tcacaccgta cttggcacat ctaactaatg caaaataaaa taagtcagca
3481 cattcccagg ctatatcttc cttggattta gcttctgcaa gttcatcagc ttcctcccta
3541 attttagcgt tcaacaaaac ttcgtcgtca aataaccgtt tggtataaga accttctgga
3601 gcattgctct tacgatccca caaggtggct tccatggctc taagaccctt tgattggcca
3661 aaacaggaag tgcgttccaa gtgacagaaa ccaacacctg tttgttcaac cacaaatttc
3721 aagcagtctc catcacaatc caattcgata cccagcaact tttgagttgc tccagatgta
3781 gcacctttat accacaaacc gtgacgacga gattggtaga ctccagtttg tgtccttata
3841 gcctccggaa tagacttttt ggacgagtac accaggccca acgagtaatt agaagagtca
3901 gccaccaaag tagtgaatag accatcgggg cggtcagtag tcaaagacgc caacaaaatt
3961 tcactgacag ggaacttttt gacatcttca gaaagttcgt attcagtagt caattgccga
4021 gcatcaataa tggggattat accagaagca acagtggaag tcacatctac caactttgcg
4081 gtctcagaaa aagcataaac agttctacta ccgccattag tgaaactttt caaatcgccc
4141 agtggagaag aaaaaggcac agcgatacta gcattagcgg gcaaggatgc aactttatca
4201 accagggtcc tatagataac cctagcgcct gggatcatcc tttggacaac tctttctgcc
4261 aaatctaggt ccaaaatcac ttcattgata ccattattgt acaacttgag caagttgtcg
4321 atcagctcct caaattggtc ctctgtaacg gatgactcaa cttgcacatt aacttgaagc
4381 tcagtcgatt gagtgaactt gatcaggttg tgcagctggt cagcagcata gggaaacacg
4441 gcttttccta ccaaactcaa ggaattatca aactctgcaa cacttgcgta tgcaggtagc
4501 aagggaaatg tcatacttga agtcggacag tgagtgtagt cttgagaaat tctgaagccg
4561 tatttttatt atcagtgagt cagtcatcag gagatcctct acgccggacg catcgtggcc
4621 ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg
4681 gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca
4741 ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg
4801 gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag
4861 ggagagcgtc gagtatctat gattggaagt atgggaatgg tgatacccgc attcttcagt
4921 gtcttgaggt ctcctatcag attatgccca actaaagcaa ccggaggagg agatttcatg
4981 gtaaatttct ctgacttttg gtcatcagta gactcgaact gtgagactat ctcggttatg
5041 acagcagaaa tgtccttctt ggagacagta aatgaagtcc caccaataaa gaaatccttg
5101 ttatcaggaa caaacttctt gtttcgaact ttttcggtgc cttgaactat aaaatgtaga
5161 gtggatatgt cgggtaggaa tggagcgggc aaatgcttac cttctggacc ttcaagaggt
5221 atgtagggtt tgtagatact gatgccaact tcagtgacaa cgttgctatt tcgttcaaac
5281 cattccgaat ccagagaaat caaagttgtt tgtctactat tgatccaagc cagtgcggtc
5341 ttgaaactga caatagtgtg ctcgtgtttt gaggtcatct ttgtatgaat aaatctagtc
5401 tttgatctaa ataatcttga cgagccaagg cgataaatac ccaaatctaa aactctttta
5461 aaacgttaaa aggacaagta tgtctgcctg tattaaaccc caaatcagct cgtagtctga
5521 tcctcatcaa cttgaggggc actatcttgt tttagagaaa tttgcggaga tgcgatatcg
5581 agaaaaaggt acgctgattt taaacgtgaa atttatctca agatctctgc ctcgcgcgtt
5641 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc
5701 tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt
5761 gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta
5821 tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag
5881 atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct
5941 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt
6001 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc
6061 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga
6121 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata
6181 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac
6241 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg
6301 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc
6361 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag
6421 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt
6481 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt
6541 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg
6601 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac
6661 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca
6721 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac
6781 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac
6841 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt
6901 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt
6961 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt
7021 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc
7081 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa
7141 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg
7201 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt
7261 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc
7321 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt
7381 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg
7441 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac
7501 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc
7561 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt
7621 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg
7681 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag
7741 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa
7801 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat
7861 tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga
7921 attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gataagctga ctcatgttgg tattgtgaaa
7981 tagacgcaga tcgggaacac tgaaaaataa cagttattat tcg
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P1715/phU6-gRNA哺乳编辑质粒 |
| P1818/phH1-gRNA哺乳编辑质粒 |
| P1646/pLenti SpBsmBI sgRNA Puro哺乳编辑质粒 |
| P1803/pcU6_3 sgRNA哺乳编辑质粒 |
| P2844/sgRNA(MS2) cloning backbone哺乳编辑质粒 |
| P1051/pAAV-CMV-mCherry-U6-sgRNA哺乳编辑质粒 |
| P4206/EZ-guideXH哺乳编辑质粒 |
| P1010/lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone哺乳编辑质粒 |
| P1284/lenti sgRNA(MS2)_puro backbone哺乳编辑质粒 |
| P4861/pLenti-sgRNA哺乳编辑质粒 |
| P2845/MS2-P65-HSF1_GFP哺乳编辑质粒 |
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文献和实验相关实验
，TaKaRa，有木有；pGM-T，天根，有木有；一些表达载体，使用最广泛的，pET 系列，Novagen 公司（默克）的；有双 MCS 的 Duet 系列载体，Novagen 的；毕赤酵母表达质粒 pPIC3.5k，pPIC9k，pPICZA，pPICZaA 等等，都是 invitrogen 的；另外一些 pYES 酿酒酵母表达系统，也是 invitrogen 的，因此知道常见的质粒是哪个公司的，去他们公司网站上肯定可以找到该质粒的相关信息。在他们公司主页搜索栏直接搜索质粒名称，得到质粒序列，图谱什么的
酵母表达质粒pPIC3.5k，pPIC9k，pPICZA，pPICZaA等等，都是invitrogen的；另外一些pYES酿酒酵母表达系统，也是invitrogen的，因此知道常见的质粒是哪个公司的，去他们公司网站上肯定可以找到该质粒的相关信息。 在他们公司主页搜索栏直接搜索质粒名称，得到质粒序列，图谱什么的都不成问题，而且可以下到表达系统操作手册，原核表达看完pET表达系统操作手册，真核系统看完毕赤酵母表达系统。 方法四：如何查找经过改造过的质粒的质粒图谱 有些质粒是经过改造
相关专题 张伍魁*范清林宋礼华 （安徽医科大学 基础医学院合肥230032） 摘要巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达 中的研究进展及应用。 关键词巴斯得毕赤酵母外源基因糖
pPIC9毕赤酵母质粒
￥100 - 1000
