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- 2025年07月05日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pPIC3.5K
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pPIC3.5K毕赤酵母质粒
别称: pPIC3.5K
质粒属性
质粒简介
PIC3.5K是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体。 1. pPIC3.5K载体大小为9004 bp。 2. 在多克隆位点区域，拥有5个单一的限制性酶切位点：BamH I，Snab I，EcoR I，Avr II和Not I。 3.胞内表达。 4.载体构建时，需要包含一个ATG启动子，同时需要加入Kozak序列。 (Cavener and Stuart, 1991; Kozak, 1987; Kozak, 1990) 5. 毕赤酵母中使用HIS4基因筛选。 6. 将基因插入GS115和KM71的AOX1中，需要使用Sac I线性化质粒(GS115产生的基因型为His+ Mut+，KM71酵母产生的基因型为His+ MutS)。 7. 将基因插入GS115和KM71的HIS4中，需要使用Sal I线性化质粒(GS115产生的基因型为His+ Mut+，KM71酵母产生的基因型为His+ MutS)。 8. 将基因插入GS115的AOX1基因中，也可以使用Bgl II 限制酶线性化质粒，产生的酵母基因型为His+ MutS。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported File 9004 bp ds-DNA circular SYN 31-1-2015
DEFINITION .
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 9004)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-1-31 from MLCC
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..9004
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
terminator 1049..1295
/gene="Pichia pastoris AOX1"
/note="AOX1 terminator"
/note="transcription terminator for AOX1"
CDS complement(1708..4242)
/codon_start=1
/gene="Pichia pastoris HIS4"
/locus_tag="
"
/product="multifunctional enzyme, required for histidine
biosynthesis"
/note="PpHIS4"
/note="auxotrophic marker for Pichia pastoris"
/protein_id="
"
/translation="MTFPLLPAYASVAEFDNSLSLVGKAVFPYAADQLHNLIKFTQSTE
LQVNVQVESSVTEDQFEELIDNLLKLYNNGINEVILDLDLAERVVQRMIPGARVIYRTL
VDKVASLPANASIAVPFSSPLGDLKSFTNGGSRTVYAFSETAKLVDVTSTVASGIIPII
DARQLTTEYELSEDVKKFPVSEILLASLTTDRPDGLFTTLVADSSNYSLGLVYSSKKSI
PEAIRTQTGVYQSRRHGLWYKGATSGATQKLLGIELDCDGDCLKFVVEQTGVGFCHLER
TSCFGQSKGLRAMEATLWDRKSNAPEGSYTKRLFDDEVLLNAKIREEADELAEAKSKED
IAWECADLFYFALVRCAKYGVTLDEVERNLDMKSLKVTRRKGDAKPGYTKEQPKEESKP
KEVPSEGRIELCKIDVSKASSQEIEDALRRPIQKTEQIMELVKPIVDNVRQNGDKALLE
LTAKFDGVALKTPVLEAPFPEELMQLPDNVKRAIDLSIDNVRKFHEAQLTETLQVET-CP
GVVCSRFARPIEKVGLYIPGGTAILPSTSLMLGVPAKVAGCKEIVFASPPKKDGTLTPE
VIYVAHKVGAKCIVLAGGAQAVAAMAYGTETVPKCDKIFGPGNQFVTAAKMMVQNDTSA
LCSIDMPAGPSEVLVIADKYADPDFVASDLLSQAEHGIDSQVILLAVDMTDKELARIED
AVHNQAVQLPRVEIVRKCIAHSTTLSVATYEQALEMSNQYAPEHLILQIENASSYVDQV
QHAGSVFVGAYSPESCGDYSSGTNHTLPTYGYARQYSGVNTATFQKFITSQDVTPEGLK
HIGQAVMDLAAVEGLDAHRNAVKVRMEKLGLI"
CDS complement(4656..5471)
/codon_start=1
/gene="aph(3')-Ia"
/product="aminoglycoside phosphotransferase"
/note="KanR"
/note="confers resistance to kanamycin in bacteria or G418
(Geneticin(R)) in eukaryotes"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
TAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDA
SDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGI
ADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF"
misc_feature 5850..6606
/note="AOX1 3' fragment"
/note="region downstream of Pichia pastoris AOX1 gene"
misc_feature 6749..6889
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
rep_origin complement(7075..7663)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(7834..8694)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(8695..8799)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag
61 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt
121 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc
181 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta
241 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta
301 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg
361 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct
421 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg
481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt
541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct
601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct
661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact
721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat
781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt
841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga
901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tcctacgtag aattccctag
961 ggcggccgcg aattaattcg ccttagacat gactgttcct cagttcaagt tgggcactta
1021 cgagaagacc ggtcttgcta gattctaatc aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag
1081 agatgcaggc ttcatttttg atactttttt atttgtaacc tatatagtat aggatttttt
1141 ttgtcatttt gtttcttctc gtacgagctt gctcctgatc agcctatctc gcagctgatg
1201 aatatcttgt ggtaggggtt tgggaaaatc attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc
1261 ccactcctct tcagagtaca gaagattaag tgagaagttc gtttgtgcaa gcttatcgat
1321 aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcaggc accgtgtatg
1381 aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata
1441 ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata tcgtccattc cgacagcatc
1501 gccagtcact atggcgtgct gctagcgcta tatgcgttga tgcaatttct atgcgcaccc
1561 gttctcggag cactgtccga ccgctttggc cgccgcccag tcctgctcgc ttcgctactt
1621 ggagccacta tcgactacgc gatcatggcg accacacccg tcctgtggat ctatcgaatc
1681 taaatgtaag ttaaaatctc taaataatta aataagtccc agtttctcca tacgaacctt
1741 aacagcattg cggtgagcat ctagaccttc aacagcagcc agatccatca ctgcttggcc
1801 aatatgtttc agtccctcag gagttacgtc ttgtgaagtg atgaacttct ggaaggttgc
1861 agtgttaact ccgctgtatt gacgggcata tccgtacgtt ggcaaagtgt ggttggtacc
1921 ggaggagtaa tctccacaac tctctggaga gtaggcacca acaaacacag atccagcgtg
1981 ttgtacttga tcaacataag aagaagcatt ctcgatttgc aggatcaagt gttcaggagc
2041 gtactgattg gacatttcca aagcctgctc gtaggttgca accgataggg ttgtagagtg
2101 tgcaatacac ttgcgtacaa tttcaaccct tggcaactgc acagcttggt tgtgaacagc
2161 atcttcaatt ctggcaagct ccttgtctgt catatcgaca gccaacagaa tcacctggga
2221 atcaatacca tgttcagctt gagacagaag gtctgaggca acgaaatctg gatcagcgta
2281 tttatcagca ataactagaa cttcagaagg cccagcaggc atgtcaatac tacacagggc
2341 tgatgtgtca ttttgaacca tcatcttggc agcagtaacg aactggtttc ctggaccaaa
2401 tattttgtca cacttaggaa cagtttctgt tccgtaagcc atagcagcta ctgcctgggc
2461 gcctcctgct agcacgatac acttagcacc aaccttgtgg gcaacgtaga tgacttctgg
2521 ggtaagggta ccatccttct taggtggaga tgcaaaaaca atttctttgc aaccagcaac
2581 tttggcagga acacccagca tcagggaagt ggaaggcaga attgcggttc caccaggaat
2641 atagaggcca actttctcaa taggtcttgc aaaacgagag cagactacac cagggcaagt
2701 ctcaacttgc aacgtctccg ttagttgagc ttcatggaat ttcctgacgt tatctataga
2761 gagatcaatg gctctcttaa cgttatctgg caattgcata agttcctctg ggaaaggagc
2821 ttctaacaca ggtgtcttca aagcgactcc atcaaacttg gcagttagtt ctaaaagggc
2881 tttgtcacca ttttgacgaa cattgtcgac aattggtttg actaattcca taatctgttc
2941 cgttttctgg ataggacgac gaagggcatc ttcaatttct tgtgaggagg ccttagaaac
3001 gtcaattttg cacaattcaa tacgaccttc agaagggact tctttaggtt tggattcttc
3061 tttaggttgt tccttggtgt atcctggctt ggcatctcct ttccttctag tgacctttag
3121 ggacttcata tccaggtttc tctccacctc gtccaacgtc acaccgtact tggcacatct
3181 aactaatgca aaataaaata agtcagcaca ttcccaggct atatcttcct tggatttagc
3241 ttctgcaagt tcatcagctt cctccctaat tttagcgttc aacaaaactt cgtcgtcaaa
3301 taaccgtttg gtataagaac cttctggagc attgctctta cgatcccaca aggtggcttc
3361 catggctcta agaccctttg attggccaaa acaggaagtg cgttccaagt gacagaaacc
3421 aacacctgtt tgttcaacca caaatttcaa gcagtctcca tcacaatcca attcgatacc
3481 cagcaacttt tgagttgctc cagatgtagc acctttatac cacaaaccgt gacgacgaga
3541 ttggtagact ccagtttgtg tccttatagc ctccggaata gactttttgg acgagtacac
3601 caggcccaac gagtaattag aagagtcagc caccaaagta gtgaatagac catcggggcg
3661 gtcagtagtc aaagacgcca acaaaatttc actgacaggg aactttttga catcttcaga
3721 aagttcgtat tcagtagtca attgccgagc atcaataatg gggattatac cagaagcaac
3781 agtggaagtc acatctacca actttgcggt ctcagaaaaa gcataaacag ttctactacc
3841 gccattagtg aaacttttca aatcgcccag tggagaagaa aaaggcacag cgatactagc
3901 attagcgggc aaggatgcaa ctttatcaac cagggtccta tagataaccc tagcgcctgg
3961 gatcatcctt tggacaactc tttctgccaa atctaggtcc aaaatcactt cattgatacc
4021 attattgtac aacttgagca agttgtcgat cagctcctca aattggtcct ctgtaacgga
4081 tgactcaact tgcacattaa cttgaagctc agtcgattga gtgaacttga tcaggttgtg
4141 cagctggtca gcagcatagg gaaacacggc ttttcctacc aaactcaagg aattatcaaa
4201 ctctgcaaca cttgcgtatg caggtagcaa gggaaatgtc atacttgaag tcggacagtg
4261 agtgtagtct tgagaaattc tgaagccgta tttttattat cagtgagtca gtcatcagga
4321 gatcctctac gccggacgca tcgtggccga cctgcagggg gggggggggc gctgaggtct
4381 gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca
4441 gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt
4501 gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt
4561 caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg
4621 ctctgccagt gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa
4681 tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc
4741 tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg
4801 tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata
4861 aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc
4921 ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca
4981 ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga
5041 tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc
5101 agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt
5161 ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg
5221 atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca
5281 tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca
5341 tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca
5401 tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga
5461 atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat
5521 gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt
5581 tccccccccc ccctgcaggt cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat
5641 atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt
5701 ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg
5761 catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc
5821 ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgagtatcta tgattggaag tatgggaatg
5881 gtgatacccg cattcttcag tgtcttgagg tctcctatca gattatgccc aactaaagca
5941 accggaggag gagatttcat ggtaaatttc tctgactttt ggtcatcagt agactcgaac
6001 tgtgagacta tctcggttat gacagcagaa atgtccttct tggagacagt aaatgaagtc
6061 ccaccaataa agaaatcctt gttatcagga acaaacttct tgtttcgaac tttttcggtg
6121 ccttgaacta taaaatgtag agtggatatg tcgggtagga atggagcggg caaatgctta
6181 ccttctggac cttcaagagg tatgtagggt ttgtagatac tgatgccaac ttcagtgaca
6241 acgttgctat ttcgttcaaa ccattccgaa tccagagaaa tcaaagttgt ttgtctacta
6301 ttgatccaag ccagtgcggt cttgaaactg acaatagtgt gctcgtgttt tgaggtcatc
6361 tttgtatgaa taaatctagt ctttgatcta aataatcttg acgagccaag gcgataaata
6421 cccaaatcta aaactctttt aaaacgttaa aaggacaagt atgtctgcct gtattaaacc
6481 ccaaatcagc tcgtagtctg atcctcatca acttgagggg cactatcttg ttttagagaa
6541 atttgcggag atgcgatatc gagaaaaagg tacgctgatt ttaaacgtga aatttatctc
6601 aagatctctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc
6661 cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg
6721 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg
6781 gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat
6841 gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc
6901 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca
6961 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg
7021 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca
7081 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa
7141 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc
7201 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc
7261 gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct
7321 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg
7381 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag
7441 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta
7501 cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg
7561 aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt
7621 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt
7681 ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag
7741 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat
7801 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc
7861 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat
7921 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc
7981 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag
8041 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag
8101 agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt
8161 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg
8221 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt
8281 tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc
8341 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc
8401 attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa
8461 taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg
8521 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc
8581 caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag
8641 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt
8701 cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt
8761 tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc
8821 acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac
8881 gaggcccttt cgtcttcaag aattaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctg
8941 actcatgttg gtattgtgaa atagacgcag atcgggaaca ctgaaaaata acagttatta
9001 ttcg
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pPIC3.5K毕赤酵母质粒
别称: pPIC3.5K
| 启动子: | AOX1 |
|---|---|
| 复制子: | pBR322 |
| 质粒分类: | 酵母系列，毕赤酵母表达载体 |
| 质粒大小: | 9004bp |
| 原核抗性: | Amp |
| 筛选标记: | HIS4 |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | 酵母细胞 |
| 5'测序引物: | AOX5:GACTGGTTCCAATTGACAAGC |
| 3'测序引物: | AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT |
质粒属性
| 载体宿主： | 酵母菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 筛选标记： | |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
PIC3.5K是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体。 1. pPIC3.5K载体大小为9004 bp。 2. 在多克隆位点区域，拥有5个单一的限制性酶切位点：BamH I，Snab I，EcoR I，Avr II和Not I。 3.胞内表达。 4.载体构建时，需要包含一个ATG启动子，同时需要加入Kozak序列。 (Cavener and Stuart, 1991; Kozak, 1987; Kozak, 1990) 5. 毕赤酵母中使用HIS4基因筛选。 6. 将基因插入GS115和KM71的AOX1中，需要使用Sac I线性化质粒(GS115产生的基因型为His+ Mut+，KM71酵母产生的基因型为His+ MutS)。 7. 将基因插入GS115和KM71的HIS4中，需要使用Sal I线性化质粒(GS115产生的基因型为His+ Mut+，KM71酵母产生的基因型为His+ MutS)。 8. 将基因插入GS115的AOX1基因中，也可以使用Bgl II 限制酶线性化质粒，产生的酵母基因型为His+ MutS。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported File 9004 bp ds-DNA circular SYN 31-1-2015
DEFINITION .
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 9004)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-1-31 from MLCC
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..9004
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
terminator 1049..1295
/gene="Pichia pastoris AOX1"
/note="AOX1 terminator"
/note="transcription terminator for AOX1"
CDS complement(1708..4242)
/codon_start=1
/gene="Pichia pastoris HIS4"
/locus_tag="
"
/product="multifunctional enzyme, required for histidine
biosynthesis"
/note="PpHIS4"
/note="auxotrophic marker for Pichia pastoris"
/protein_id="
"
/translation="MTFPLLPAYASVAEFDNSLSLVGKAVFPYAADQLHNLIKFTQSTE
LQVNVQVESSVTEDQFEELIDNLLKLYNNGINEVILDLDLAERVVQRMIPGARVIYRTL
VDKVASLPANASIAVPFSSPLGDLKSFTNGGSRTVYAFSETAKLVDVTSTVASGIIPII
DARQLTTEYELSEDVKKFPVSEILLASLTTDRPDGLFTTLVADSSNYSLGLVYSSKKSI
PEAIRTQTGVYQSRRHGLWYKGATSGATQKLLGIELDCDGDCLKFVVEQTGVGFCHLER
TSCFGQSKGLRAMEATLWDRKSNAPEGSYTKRLFDDEVLLNAKIREEADELAEAKSKED
IAWECADLFYFALVRCAKYGVTLDEVERNLDMKSLKVTRRKGDAKPGYTKEQPKEESKP
KEVPSEGRIELCKIDVSKASSQEIEDALRRPIQKTEQIMELVKPIVDNVRQNGDKALLE
LTAKFDGVALKTPVLEAPFPEELMQLPDNVKRAIDLSIDNVRKFHEAQLTETLQVET-CP
GVVCSRFARPIEKVGLYIPGGTAILPSTSLMLGVPAKVAGCKEIVFASPPKKDGTLTPE
VIYVAHKVGAKCIVLAGGAQAVAAMAYGTETVPKCDKIFGPGNQFVTAAKMMVQNDTSA
LCSIDMPAGPSEVLVIADKYADPDFVASDLLSQAEHGIDSQVILLAVDMTDKELARIED
AVHNQAVQLPRVEIVRKCIAHSTTLSVATYEQALEMSNQYAPEHLILQIENASSYVDQV
QHAGSVFVGAYSPESCGDYSSGTNHTLPTYGYARQYSGVNTATFQKFITSQDVTPEGLK
HIGQAVMDLAAVEGLDAHRNAVKVRMEKLGLI"
CDS complement(4656..5471)
/codon_start=1
/gene="aph(3')-Ia"
/product="aminoglycoside phosphotransferase"
/note="KanR"
/note="confers resistance to kanamycin in bacteria or G418
(Geneticin(R)) in eukaryotes"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
TAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDA
SDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGI
ADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF"
misc_feature 5850..6606
/note="AOX1 3' fragment"
/note="region downstream of Pichia pastoris AOX1 gene"
misc_feature 6749..6889
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
rep_origin complement(7075..7663)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(7834..8694)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(8695..8799)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag
61 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt
121 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc
181 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta
241 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta
301 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg
361 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct
421 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg
481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt
541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct
601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct
661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact
721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat
781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt
841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga
901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tcctacgtag aattccctag
961 ggcggccgcg aattaattcg ccttagacat gactgttcct cagttcaagt tgggcactta
1021 cgagaagacc ggtcttgcta gattctaatc aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag
1081 agatgcaggc ttcatttttg atactttttt atttgtaacc tatatagtat aggatttttt
1141 ttgtcatttt gtttcttctc gtacgagctt gctcctgatc agcctatctc gcagctgatg
1201 aatatcttgt ggtaggggtt tgggaaaatc attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc
1261 ccactcctct tcagagtaca gaagattaag tgagaagttc gtttgtgcaa gcttatcgat
1321 aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcaggc accgtgtatg
1381 aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata
1441 ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata tcgtccattc cgacagcatc
1501 gccagtcact atggcgtgct gctagcgcta tatgcgttga tgcaatttct atgcgcaccc
1561 gttctcggag cactgtccga ccgctttggc cgccgcccag tcctgctcgc ttcgctactt
1621 ggagccacta tcgactacgc gatcatggcg accacacccg tcctgtggat ctatcgaatc
1681 taaatgtaag ttaaaatctc taaataatta aataagtccc agtttctcca tacgaacctt
1741 aacagcattg cggtgagcat ctagaccttc aacagcagcc agatccatca ctgcttggcc
1801 aatatgtttc agtccctcag gagttacgtc ttgtgaagtg atgaacttct ggaaggttgc
1861 agtgttaact ccgctgtatt gacgggcata tccgtacgtt ggcaaagtgt ggttggtacc
1921 ggaggagtaa tctccacaac tctctggaga gtaggcacca acaaacacag atccagcgtg
1981 ttgtacttga tcaacataag aagaagcatt ctcgatttgc aggatcaagt gttcaggagc
2041 gtactgattg gacatttcca aagcctgctc gtaggttgca accgataggg ttgtagagtg
2101 tgcaatacac ttgcgtacaa tttcaaccct tggcaactgc acagcttggt tgtgaacagc
2161 atcttcaatt ctggcaagct ccttgtctgt catatcgaca gccaacagaa tcacctggga
2221 atcaatacca tgttcagctt gagacagaag gtctgaggca acgaaatctg gatcagcgta
2281 tttatcagca ataactagaa cttcagaagg cccagcaggc atgtcaatac tacacagggc
2341 tgatgtgtca ttttgaacca tcatcttggc agcagtaacg aactggtttc ctggaccaaa
2401 tattttgtca cacttaggaa cagtttctgt tccgtaagcc atagcagcta ctgcctgggc
2461 gcctcctgct agcacgatac acttagcacc aaccttgtgg gcaacgtaga tgacttctgg
2521 ggtaagggta ccatccttct taggtggaga tgcaaaaaca atttctttgc aaccagcaac
2581 tttggcagga acacccagca tcagggaagt ggaaggcaga attgcggttc caccaggaat
2641 atagaggcca actttctcaa taggtcttgc aaaacgagag cagactacac cagggcaagt
2701 ctcaacttgc aacgtctccg ttagttgagc ttcatggaat ttcctgacgt tatctataga
2761 gagatcaatg gctctcttaa cgttatctgg caattgcata agttcctctg ggaaaggagc
2821 ttctaacaca ggtgtcttca aagcgactcc atcaaacttg gcagttagtt ctaaaagggc
2881 tttgtcacca ttttgacgaa cattgtcgac aattggtttg actaattcca taatctgttc
2941 cgttttctgg ataggacgac gaagggcatc ttcaatttct tgtgaggagg ccttagaaac
3001 gtcaattttg cacaattcaa tacgaccttc agaagggact tctttaggtt tggattcttc
3061 tttaggttgt tccttggtgt atcctggctt ggcatctcct ttccttctag tgacctttag
3121 ggacttcata tccaggtttc tctccacctc gtccaacgtc acaccgtact tggcacatct
3181 aactaatgca aaataaaata agtcagcaca ttcccaggct atatcttcct tggatttagc
3241 ttctgcaagt tcatcagctt cctccctaat tttagcgttc aacaaaactt cgtcgtcaaa
3301 taaccgtttg gtataagaac cttctggagc attgctctta cgatcccaca aggtggcttc
3361 catggctcta agaccctttg attggccaaa acaggaagtg cgttccaagt gacagaaacc
3421 aacacctgtt tgttcaacca caaatttcaa gcagtctcca tcacaatcca attcgatacc
3481 cagcaacttt tgagttgctc cagatgtagc acctttatac cacaaaccgt gacgacgaga
3541 ttggtagact ccagtttgtg tccttatagc ctccggaata gactttttgg acgagtacac
3601 caggcccaac gagtaattag aagagtcagc caccaaagta gtgaatagac catcggggcg
3661 gtcagtagtc aaagacgcca acaaaatttc actgacaggg aactttttga catcttcaga
3721 aagttcgtat tcagtagtca attgccgagc atcaataatg gggattatac cagaagcaac
3781 agtggaagtc acatctacca actttgcggt ctcagaaaaa gcataaacag ttctactacc
3841 gccattagtg aaacttttca aatcgcccag tggagaagaa aaaggcacag cgatactagc
3901 attagcgggc aaggatgcaa ctttatcaac cagggtccta tagataaccc tagcgcctgg
3961 gatcatcctt tggacaactc tttctgccaa atctaggtcc aaaatcactt cattgatacc
4021 attattgtac aacttgagca agttgtcgat cagctcctca aattggtcct ctgtaacgga
4081 tgactcaact tgcacattaa cttgaagctc agtcgattga gtgaacttga tcaggttgtg
4141 cagctggtca gcagcatagg gaaacacggc ttttcctacc aaactcaagg aattatcaaa
4201 ctctgcaaca cttgcgtatg caggtagcaa gggaaatgtc atacttgaag tcggacagtg
4261 agtgtagtct tgagaaattc tgaagccgta tttttattat cagtgagtca gtcatcagga
4321 gatcctctac gccggacgca tcgtggccga cctgcagggg gggggggggc gctgaggtct
4381 gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca
4441 gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt
4501 gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt
4561 caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg
4621 ctctgccagt gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa
4681 tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc
4741 tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg
4801 tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata
4861 aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc
4921 ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca
4981 ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga
5041 tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc
5101 agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt
5161 ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg
5221 atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca
5281 tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca
5341 tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca
5401 tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga
5461 atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat
5521 gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt
5581 tccccccccc ccctgcaggt cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat
5641 atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt
5701 ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg
5761 catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc
5821 ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgagtatcta tgattggaag tatgggaatg
5881 gtgatacccg cattcttcag tgtcttgagg tctcctatca gattatgccc aactaaagca
5941 accggaggag gagatttcat ggtaaatttc tctgactttt ggtcatcagt agactcgaac
6001 tgtgagacta tctcggttat gacagcagaa atgtccttct tggagacagt aaatgaagtc
6061 ccaccaataa agaaatcctt gttatcagga acaaacttct tgtttcgaac tttttcggtg
6121 ccttgaacta taaaatgtag agtggatatg tcgggtagga atggagcggg caaatgctta
6181 ccttctggac cttcaagagg tatgtagggt ttgtagatac tgatgccaac ttcagtgaca
6241 acgttgctat ttcgttcaaa ccattccgaa tccagagaaa tcaaagttgt ttgtctacta
6301 ttgatccaag ccagtgcggt cttgaaactg acaatagtgt gctcgtgttt tgaggtcatc
6361 tttgtatgaa taaatctagt ctttgatcta aataatcttg acgagccaag gcgataaata
6421 cccaaatcta aaactctttt aaaacgttaa aaggacaagt atgtctgcct gtattaaacc
6481 ccaaatcagc tcgtagtctg atcctcatca acttgagggg cactatcttg ttttagagaa
6541 atttgcggag atgcgatatc gagaaaaagg tacgctgatt ttaaacgtga aatttatctc
6601 aagatctctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc
6661 cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg
6721 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg
6781 gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat
6841 gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc
6901 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca
6961 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg
7021 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca
7081 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa
7141 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc
7201 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc
7261 gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct
7321 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg
7381 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag
7441 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta
7501 cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg
7561 aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt
7621 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt
7681 ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag
7741 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat
7801 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc
7861 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat
7921 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc
7981 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag
8041 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag
8101 agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt
8161 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg
8221 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt
8281 tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc
8341 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc
8401 attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa
8461 taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg
8521 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc
8581 caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag
8641 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt
8701 cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt
8761 tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc
8821 acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac
8881 gaggcccttt cgtcttcaag aattaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctg
8941 actcatgttg gtattgtgaa atagacgcag atcgggaaca ctgaaaaata acagttatta
9001 ttcg
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P2180/Fuw-dCas9-Dnmt3a_IM哺乳编辑质粒 |
| P2277/pST1374-NLS-FLAG-linker-Cas9哺乳编辑质粒 |
| P2501/pRosa26-EF1a-hCas9IRESneo哺乳编辑质粒 |
| P2674/PB-TRE-dCas9-VPR哺乳编辑质粒 |
| P2841/xCas9(3.7)-ABE(7.10)哺乳编辑质粒 |
| P2842/lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro哺乳编辑质粒 |
| P2843/dCAS9-VP64_GFP哺乳编辑质粒 |
| P2886/lenti dCAS-VP64_Blast哺乳编辑质粒 |
| P2885/pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry哺乳编辑质粒 |
| P2923/PY094哺乳编辑质粒 |
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文献和实验相关实验
，TaKaRa，有木有；pGM-T，天根，有木有；一些表达载体，使用最广泛的，pET 系列，Novagen 公司（默克）的；有双 MCS 的 Duet 系列载体，Novagen 的；毕赤酵母表达质粒 pPIC3.5k，pPIC9k，pPICZA，pPICZaA 等等，都是 invitrogen 的；另外一些 pYES 酿酒酵母表达系统，也是 invitrogen 的，因此知道常见的质粒是哪个公司的，去他们公司网站上肯定可以找到该质粒的相关信息。在他们公司主页搜索栏直接搜索质粒名称，得到质粒序列，图谱什么的
酵母表达质粒pPIC3.5k，pPIC9k，pPICZA，pPICZaA等等，都是invitrogen的；另外一些pYES酿酒酵母表达系统，也是invitrogen的，因此知道常见的质粒是哪个公司的，去他们公司网站上肯定可以找到该质粒的相关信息。 在他们公司主页搜索栏直接搜索质粒名称，得到质粒序列，图谱什么的都不成问题，而且可以下到表达系统操作手册，原核表达看完pET表达系统操作手册，真核系统看完毕赤酵母表达系统。 方法四：如何查找经过改造过的质粒的质粒图谱 有些质粒是经过改造
完善，其开发出的快速筛选表达试剂盒(包括质粒pPICZ和pPICZa及其它必需材料)、多拷贝表达试剂盒(包括质粒pPIC3．5k，pPIC9k及 pAO815及其它必需材料)以及经典表达试剂盒(包括质粒pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2及 pHIL．S1及其它必需材料)大大方便了科研工作者的实验工作。而对后期发酵过程和培养基配方等尚有待于进一步开展开创性的探索研究，突破传统培养发酵模式，优化培养基配方，为提高外源蛋白的表达量作出有益的探索。 3、缺陷及对策 尽管甲醇营养型酵母表达系统被认为
pPIC3.5K毕赤酵母质粒
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