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- Xybio
- 上海
- P0358
- 2025年07月13日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pEE6.4
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
名称：pEE6.4哺乳抗体质粒
别称:pEE6.4
| 启动子: | hCMV |
|---|---|
| 复制子: | Pee6 |
| 终止子: | SV40 poly(A) signal |
| 质粒分类: | 哺乳细胞，抗体表达载体 |
| 质粒大小: | 5067bp |
| 原核抗性: | Amp |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | 哺乳细胞 |
| 诱导方式: | 无须诱导，瞬时表达 |
| 5'测序引物: | CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 3'测序引物: | 根据序列设计引物 |
质粒属性
| 载体宿主： | 哺乳细胞 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达,抗体表达 |
| 基因种属： | 空载体 |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
Lonza生物公司的Glutamine Synthetase(GS, 谷氨酰胺合成酶)基因表达系统载体pEE6.4载体，利用谷氨酰胺合成酶筛选标记，能够高水平的在哺乳细胞内表达目的基因。GS酶是生物体内以谷氨酸和氨为底物合成谷氨酰胺的酶。GS酶的活性能够被甲硫氨酸砜亚胺（methionine sulphoximine，MSX）选择性的抑制。一些哺乳动物细胞，例如小鼠骨髓瘤细胞(NSO细胞系)无法表达GS，所以在不添加谷氨酰胺的情况下， 细胞将无法生长。对于这些细胞系，在无谷氨酰胺的培养基内，一个转染的GS基因可以作为一个筛选标记。其他的一些细胞系，例如CHO-KI，能够产生内源 性的GS酶。对于这些细胞，在无谷氨酰胺培养基内，在高水平足够抑制GS酶合成的MSX（甲硫氨酸砜亚胺）的作用下，可以对细胞的生长提供一个选择压力。
质粒图谱
质粒序列：详询
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P2894/pENTR223-AP2M1（2同义突变）人源基因质粒 |
| P2895/pENTR223-SETDB1人源基因质粒 |
| P2896/pENTR223-SLC18A1（1-1146bp）人源基因质粒 |
| P2897/pENTR223-ZMYND10人源基因质粒 |
| P2898/pENTR223-HDAC3（1同义突变）人源基因质粒 |
| P2899/pENTR223-KRT18-T502C人源基因质粒 |
| P2900/pENTR223-DCAF15（493-1803bp）人源基因质粒 |
| P2901/pENTR223-ASTN2-C1262T人源基因质粒 |
| P2902/pENTR223-SLC30A4人源基因质粒 |
| P2903/pENTR223-CLASP2人源基因质粒 |
| P2904/pENTR223-KLHDC3人源基因质粒 |
| P2905/pENTR223-KRR1-T617C人源基因质粒 |
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文献和实验为非溶性蛋白，也可被单克隆抗体柱层析，重新还原的产物可以被抗Derpl血清识别，其结合率优于pGEX克隆产物。为了减少繁琐，表达更好的重组蛋白，有人尝试以Der p1的原酶和酶原放人同一酵母载体表达，效果良好。 3．哺乳动物表达 构建一个扩大的载体PEE6．HCMV．GS，从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达Derpl和Derp2。人巨细胞病毒(CMV)启动子(ACMD)和谷胱甘肽合成酶基因，通过放大质粒拷贝数增加细胞内酶高效表达，以控制抗代谢产物硫代
，然后加入临床血清标本，反应后，再吸出标本进行检测。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG。 (4)测定抗原 时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂：如2—巯基乙醇。2—巯基乙醇等还原剂可使抗体内的巯基裂解，因而可以去除RF的干扰，但只适用于抗原测定。 (5)包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体IgY：RF不与鸡IgY反应，如果包被和酶标二抗均为鸡IgY抗体，则不受标本中RF的干扰。 2.补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相特异
检验，从而保证相应检测项目结果的可靠性及临床应用价值。 (2)改变酶标抗体：由于RF结合的是IgG的Fc片段，如果将待酶标的抗体的F，片段酶切夫除，仅留下具有特异结合功能的F(ab’)2部分标记酶，则在测定中即可避免RF的干扰。 (3)标本中RF用变性IgG预先封闭：将经热变性（63℃，10min）的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中，或是将该变性IgG连接至一颗粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入临床血清标本，反应后，再吸出标本进行检测。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床
