MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
检测步骤
1、将细胞板放置于无菌操作台中(细菌可以导致MTT比色OD值的升高)
2、在每管MTT(5 mg/每管)中加入1 mL MTT Solvent溶解。在细胞板中每孔加入10%体积的MTT溶液。
注:MTT 对光敏感。重溶的MTT溶液冻存于0℃以下时的稳定性可至少保持6个月。重溶的MTT溶液如保存于2 - 8℃超过2周,则可能会降解,导致错误的结果。
3、将细胞板放回培养箱中继续孵育3 - 4小时。做对比试验时,孵育时间需一致。
4、孵育后将细胞板从培养箱中拿出,按照下面的方法溶解产生的MTT甲臜结晶物。
a. 如果是贴壁细胞,则弃去培养基。加入与初始体积等量的Formazan Solvent。每孔的溶解液体积可能不同,但为了方便比较,总体积须保持一致。
b. 如果是非贴壁细胞先离心去除上清液,再加入与初始体积等量的Formazan Solvent。
c. 加入 Formazan Solvent后,须在1小时内完成读数。
5、在摇床中温和地振荡可增强溶解。某些情况下,尤其是细胞密度较高时,需要反复吹打使 MTT甲臜结晶物完全溶解。
6、将细胞板放置于无菌操作台中(细菌可以导致MTT比色OD值的升高)。
注意事项
1、一般情况下,96孔培养板内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,保证MTT结晶形成的量与细胞数呈线性关系;
2、为了得到结果,细胞数量应在对数生长期进行测定。每次检测需包括不含细胞的培养基作为空白对照;
3、细胞消化会影响细胞的活性,进而影响OD值。容易消化的细胞,消化时胰蛋白酶中不添加EDTA,消化时也仅需胰酶浸润数秒即可;难以消化的细胞,胰蛋白酶中需添加浓度为0.25%的EDTA;
4、MTT转化为甲臜是依赖于细胞类型的。由于相同细胞系不同细胞株之间的差异,以及细胞的生理状态影响,因此推荐研究者建立自己的吸光度/细胞数量曲线;
5、细菌、支原体和其他微生物污染可能会使MTT四唑环断裂,不能用该方法测定;
6、用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值,增加试验本底。因此,一般选含小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
7、CCK-8法也是常见的细胞增殖检测方法,底物被细胞中的脱氢酶还原,生成黄色的产物(甲瓒),可溶于培养基。相较于MTT,CCK-8具有如下优点:①单一组分,无需预混,即开即用;②操作简便,只需一步即可得到结果;③无需放射性同位素和有机溶剂,对细胞毒性低;④水溶液,无需换液,尤其适合悬浮细胞。
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