pCDNA3-mTOR

产品名称：pCDNA3-mTOR
产品规格：0.5ug质粒干粉（实际规格可能会有出路，具体规格价格请和客服核实）
       亲爱的科研工作者，感谢您信任晶风生物，我们致力于为大家分享质优价适的质粒，受各种因素影响，我们只保证质粒的关键序列测序正确，不能保证实验效果。请您收到质粒后请务必先转化，再挑取单菌落扩增，不要直接使用。如果您需要即用的大包装质粒或病毒颗粒，可委托我们制备，性价比更高。
pCDNA3-mTOR扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h，（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
转化图片：

pCDNA3-mTOR提取步骤：（本步骤仅做示例，非该产品实际提取步骤）
实验原理：
        碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、操作步骤：
        1. 准备20ml灭菌过的培养管，编号，分别加入8ml LB培养基，再加入8µl 相应抗生素，可适量多加；
        2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）；
        3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，室温10000rpm离心2min，去上清；（可重复步骤2，直至菌液离心完）（去上清时用纸吸一下）
        4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液枪充分混匀，悬浮菌体菌体；
        5. 向离心管中加入250µl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液；（剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度）
        6. 向离心管中加入350µl Buffer N3， 立即温和地上下颠倒混匀4~6次，此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min；
        7. 小心将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min，至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液；
        8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
        9. 向吸附柱中加400µl  Buffer PW（检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。再空离一次，2min（此时可以加热 Buffer EB，65~70℃）；
        10. 将吸附柱置于一个新的离心管中，打开盖子，吹风4min左右（确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤）；
        11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加90µl Buffer EB（pET系列拷贝数低，加EB 70μl即可），室温静置2min。10000rpm离心1min；
        12. 把液体倒回吸附柱，在10000rpm离心1min；
        13. 混合质粒至一个离心管中，做好标记，开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。

三、注意事项：
        1.使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
        2.Buffer EB在65~70℃水浴预热，可以增加提取效率。
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