同意二楼,原因可能是ECL底物过强了,尝试弱一点的
整张片子都黑,和曝光过度有关,是不是你的暗房光线太强了。我都是抹黑操作,只有一个小红灯,还罩上黑塑料带。
5%脱脂奶粉封闭4°过夜,应该不会出现这种问题的,还有你孵育抗体后洗膜的时间得延长,同时降低一抗浓度,你这个图片的背景太深了
1,有没有LiCor Odessey的机子?可以用IRDye标记二抗试试。2,不能换显影方法的话,一抗二抗都用一半浓度的封闭液配。整张膜深的话,我一般会降低一抗稀释比例(更浓)、升高二抗稀释比例(更稀),你可以试试。但是没有遇到过你这样“反影”的情况,只有actin超级过曝时见过,你可以用弱一些的ECL,没有弱的就用TBST稀释一倍使用。
你的抗体是不是多抗?一般多抗容易出现这样的问题。一般这样也是提示抗体很好,abcam的抗体是比较好的了,建议如果是多抗的话,可以减少曝光的时间,降低一抗浓度,适当提高二抗浓度,增加对比度试试