如果实验经常出现这种问题,可能就是您该换荧光二抗的时候了[微笑]如果参考LI-COR Odyssey的建议,您首先要确保内参的可靠性,其次,需要确保成像系统没有过曝(内参由于丰富高,一般的ECL成像非常容易过曝),因为过曝后的数据不具备参考性。
最终的曝光步骤也挺关键的,压片的力度 均匀度,时间,以及ECL的残留都会对条带有影响,
1.你蛋白的问题,虽然是同一批的,但是可能在蛋白表达与纯化过程中难免会出现个别的异类;2.你的操作流程,不管做什么都会有误差,不可能每次的做的都一样,我们只能减少误差,所以可能你觉得自己每次都做得一样,但是可能某个小细节你并没有发现;3.试剂,也许你的试剂已经不能用了,或者溶度不对了都会影响你的实验。做一个实验来说唯一原则就是精准,也许你这次做出来了下次就做不出来了,每次做的时候写下来,不要嫌麻烦,这样做错了能省很多时间。
我也出现这种情况,我做的是组织蛋白更不稳定,内参跑的很漂亮但是目的条带只能呵呵了,我个人觉得因为内参蛋白本身比较稳定而且内参抗体也很成熟所以相对出结果比较好看,而目的抗体就不一样了,样本之间的差别还有抗体的问题(如一二抗特异性,浓度等),光是这两个因素就够做好一阵子了,只能不断摸索了。
一抗敷的不均匀吧 洗膜也可能没有洗干净