在C末端加入标签
在蛋白的C末端加入标签的好处是显而易见的:可以利用基因本身的ATG作为起始密码子,保证了蛋白天然的N末端,这对于一些医药用的重组蛋白是相当重要的;同时可以纯化出那些完整表达的蛋白,一些在翻译过程中容易造成“暂停”现象的蛋白就不用怕纯化产物里含有不完整的产物。融合了6×组氨酸标签的有pQE-60和pQE-70,融合了6×His-DHFR的有pQE-16。
顺式抑制载体
pQE系列的表达载体一般情况下需要在M15菌株中进行表达的,但是设计的pQE80L系列就没有这种约束,它可以在任意大肠杆菌株中进行表达。这与一般的pQE载体利用M15中质粒pREP4的反式lacI抑制子调控不同,它是利用顺式lacIq调控产生大量lac抑制子从而在加入IPTG诱导前起到阻遏蛋白表达的作用。阻遏外源蛋白的本底表达对于那些含有毒性的蛋白来说是十分重要的。
多系统表达载体
pQE-TriSystem载体含有大肠杆菌的T5启动子,哺乳动物的CAG启动子和杆状病毒的p10启动子。因此它可以同时在三个系统中进行表达。这与Invitrogen的Gateway技术有异曲同工之妙,它在操作上比Invitrogen的Gateway还要方便,因为Gateway技术在构建入门克隆后与每个载体仍需一次重组反应。
His・Strep pQE-TriSystem含有两个蛋白标签,分别是6×组氨酸标签和短的Strep-标签Ⅱ。利用这两个标签,可以用Ni-NTA和Strep-Tactin填料进行两步纯化,这样分离的蛋白可以最高纯度可以达到98%。而且操作也十分方便,将裂解后的上清先上到Ni-NTA柱,然后用咪唑将蛋白洗脱,之后可以直接把洗脱液上到含有Strep-Tactin的柱子进行纯化。这两者间的顺序可以互换。
含有切除标签蛋白酶切位点载体
Qiagen提供两种可以切除组氨酸标签的方式,一种是利用DAPase的TAGZyme系列,另外一个就是利用Xa因子的Xa系列。
TAGZyme系统的主要组成部分是一种外切蛋白酶――二肽氨基肽酶Ⅰ(dipeptidyl aminopeptidase I,DAPase),如果你表达的外源蛋白不含有外切酶识别的停顿位点,那么你还需要联合使用谷氨酸循环转移酶(glutamine cyclotransferase,Qcyclase)和焦谷氨酸氨基肽酶(pyroglutamyl aminopeptidase,pGAPase)。这些酶都经过重组,可以通过Ni-NTA填料除去。应用TAGZyme系统的反应是十分灵敏的,不会存在有内切的现象,并且切割效率高,一些灵敏的蛋白可以在4℃进行反应,最大程度地防止了蛋白地降解。这个系列有两个载体,当你的外源不含有DAPase停顿位点的时候可以使用TAGZyme pQE-1,它可以在你的外源蛋白前面人工加入停顿位点谷氨酸残基,之后利用Qcyclase将它转成焦谷氨酸成为一个外切酶的停顿位点。对于那些外源蛋白中已经含有外切酶停顿位点的,可以选用TAGZyme pQE-2。
另一种可以利用蛋白酶出去组氨酸标签的是pQE-30 Xa载体,它是在pQE-30载体上构建起来的,在6×组氨酸和外源蛋白之间含有一个Xa因子蛋白酶识别位点,Xa因子可以从识别位点的精氨酸后准确将外源蛋白分离而不带有任何载体加入的氨基酸。之后Xa因子蛋白酶可以利用树脂分离出来。
含有双标签载体
pQE-100 DoubleTag是带有两个标签的载体,除了在N末端的6×组氨酸外,在C末端还有12个来自哺乳动物MAP激酶2的氨基酸构成的Tag・100。当蛋白的组氨酸端利用Ni-NTA填料固定住的时候,另一端暴露的Tag・100可以被抗体检测。这样在进行ELISA、药物和蛋白定量等筛选过程时就非常方便。
以上就是Qiagen载体这块的基本情况,当然原核表达还有一个重要的因素,就是表达菌株。一般情况下pQE系列载体建议在M15菌株中进行表达。M15含有卡那霉素抗性的质粒pREP4,同时它带有表达lac抑制子的基因,可以高效表达lac抑制子,紧紧地阻遏着外源蛋白的表达。它利用p15A复制元,可以与ColE1复制起点的质粒载体兼容。在利用M15表达效果不好的时候可以考虑SG13008[pREP4]菌株,它和M15同样是来源于K12的衍生菌株。
一些lacq突变的菌株,例如:XL1 Blue,JM109和TG1,可以制造足够的lac抑制子有效的阻断转录,是储藏并繁衍pQE质粒的理想菌株。这些菌株也可以作为表达无毒害蛋白的宿主菌,但是它们的表达效率可能比M15要低,同时控制程度也没有M15那么严谨。
Qiagen的表达菌株也具有抗性,这样就保证了在加入IPTG诱导前不会有任何外源蛋白的本底表达,因为如果菌株在传代过程中失去了pREP4,也就丧失了卡那抗性,因此会被抗生素消灭掉,剩下的都是含有抗性和lac抑制子的细菌。虽然这个设计会给我们带来一定的麻烦并提高培养基的成本,但是在菌株培养过程中难免会有突变产生或者实验室污染情况,如果你不幸挑到无法紧密调控的菌株你可能很久就困在这个应该是非常simple的实验里了。其它品牌的表达菌株很少会设计抗性,这让我们再一次见识了“Made in Germany”的一丝不苟。