WB 过程中常见问题及建议大汇总

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Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

WB 实验中常会出现各种问题，迪申生物技术（上海）有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年，对 WB 实验有一定了解，今天跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策。

问题	可能原因	建议
电泳条带成笑脸状	胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高	减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳
电泳条带成皱眉状	可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全	调整装置
拖尾	样品溶解不好	样品充分溶解混匀后上样
纹理(纵向条纹)	样品中含有不溶性颗粒	样品充分搅拌混匀
条带偏斜	电极不平衡或者加样位置偏斜	调整电极和加样
条带两边扩散	加样量过多	适当减少上样量
Marker 变黑色	抗体和 Marker 蛋白反应	在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样
背景高	膜封闭不够	延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度
	一抗稀释度不适宜	对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度
	一抗孵育的温度偏高	建议 4℃ 结合过夜
	二抗浓度度过高	降低二抗浓度
	二抗的非特异性背景	增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）
	二抗孵育时间过久	减少二抗孵育时间
	选择膜的问题	硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低
	膜在实验过程中干过	实验过程中要注意保持膜的湿润
	检测时曝光时间过长	注意曝光时间的缩短
	洗膜不充分	增加洗膜的时间和次数
	抗体和封闭蛋白有交叉反应	检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应
杂带较多	目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带	查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小
	目的蛋白有其他剪切本	查阅文献或生物信息学分析可能性
	样品处理过程中目的蛋白发生降解	裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行
	上样量过高，太敏感	适当减少上样量
	一抗不纯	纯化抗体
	一抗特异性不高	重新选择或制备高特异性的抗体
	二抗的非特异性结合	增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）
	一抗或二抗浓度偏高	降低抗体浓度
	细胞传代较多，导致蛋白变异	使用原代或传代少的细胞作对照
蛋白条带位置（大小）不对	二聚体或多聚体存在	增加蛋白质变性过程及强度
	翻译后剪切	比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式
	相对电荷	氨基酸电荷的组成
	蛋白修饰	比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加
	胶浓度	不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差
无蛋白条带	抗体孵育不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶失活	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
	标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因
	试剂之间不匹配	一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
	一抗失效	选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液
	HRP 抑制剂	所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
	抗体不能识别测试种属的相关蛋白	购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
	二抗与一抗不匹配	选择针对一抗来源种属的抗体
蛋白条带信号弱	抗体孵育不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶活性降低	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
	洗膜过度	洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20
	标本中靶蛋白含量太低	增加样本上样量
	抗体活性降低	选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
	蛋白转移不充分	可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流
	封闭过度	减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型
	曝光时间过短	延长曝光时间
	HRP 抑制剂	所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
背景有黑色斑点	抗体与封闭试剂反应	使用前过滤封闭试剂
背景有黑色斑点	HRP 偶联二抗中有聚集体	过滤二抗试剂，去除聚集体
暗背景上白色带	HRP 含量过高	降低酶联二抗的浓度
背景有不均匀的白色斑点	转膜过程中有气泡存在	仔细检测，避免存在气泡
背景有不均匀的白色斑点	抗体分布不均匀	孵育抗体时使用摇床