关键词: RNA 提取 策略 RT-PCR技术
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3、提高逆转录保温温度较高的温度有助于RNA二级结构的打开,增加了反应的产量。对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将RNA和引物(三种引物都可以的)在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤之后反应条件如何设置我没有经验,是加入酶和其他反应组分后变性再RT还是直接开始RT程序?我认为后者才对。此外是否可以考虑加入RNA inhibitor更为安全一些。还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度,并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。然而某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性后也是如此。上面简单的处理方法倒是不花钱,呵呵。对这些困难模板的扩增可以使用一些特殊的逆转录酶,逆转录反应可以置于较高温度下进行,增加特异性,尤其是当使用基因特异性引物(GSP)进行cDNA合成时。如果使用GSP,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。此外注意不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。此外RNA在高于65℃时开始水解,对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃,对于>1kb的RNA则需要<65℃。
4、使用逆转录反应的增强剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中,可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构,最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MmlV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中,那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%,这不足以抑制PCR。5、RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板,据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合,在这种情况下,RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时,RNaseH处理是必需的,比如低拷贝的tuberous scherosisⅡRNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应,RNaseH处理是可选的,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA:DNA复合物中的RNA水解掉。通常是不推荐此方法的。
三种RT引物的选择
Oligo dT 要求RNA必须有Poly A,所以真核生物的mRNA适用。他主要适合长链甚至全长mRNA的RT,这样对RNA样品的质量要求较高,最好不要有明显的DNA污染,RNA降解和RNA断裂(如电泳中出现多条非典型的带而又明确不是DNA带那么就要考虑RNA出现断裂的情况)其RT通常有标准浓度,比较好掌握。随机引物适合各种RNA的RT,尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低),关于是否对具有复杂二级结构的模板有特殊的优点只能说maybe,事实上很多情况下我们是没有分析RNA的二级结构的。(我用RNAstructure分析,但是一般分析发现复杂二级结构不是想到换用随机引物,而是考虑做巢式PCR或者考虑做二步PCR,因为引物设计处有连续复杂的二级结构设计引物就会设计不出来,但是如果引物退火处后面不远就出现连续复杂的二级结构那么不用二级结构分析软件是不容易发现的而且它也会严重影响PCR扩增)事实上引物退火后面不远处如何出现严重连续二级结构是我们需要注意的,改用随机引物做RT倒是是比较好的选择,但是如果不在PCR阶段针对性的修改策略是不行的。特异性引物注意只能用你设计引物时的下游引物做RT,自己画图就明白了。适合各种RNA的RT,适合序列肯定的模板,常用于一步法RT-PCR。但是引物设计质量影响RT的结果,而且不同引物退火温度本来就不相同,所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择,这样对操作者的技战术水平提出了严峻挑战。所以通常适用于引物设计和合成有保障,引物退火处之后没有复杂二级结构,目的模板丰度高(注意丰度高是指的目的gene的mRNA丰度高,与总RAN是两个概念)的情况。通常不推荐。有些试剂核诸如Qiagen的RT试剂盒很讨厌不带随机引物和Oligo dT,这时可以先用特异性引物试一试,看看情况再说,做不出来也不要紧,这不是RT的最佳选择,只是不用多花钱的妥协选择而已^_^。至于其合成的cDNA更为特异从而以后PCR更为特异的说法虽然有一定的道理,但是纯属于理论性质的,不能作为选择他的原因。通常加入某个引物(模板其实没有这个序列)RT,然后用这个引物扩增还是可以得到很多非特异扩增产物的,只是片断一般不超过400bp。所以使用特异性引物特异性更高的说法不能全信,尤其是扩增片断比较短的时候(小于400bp)。因为很少有RT酶可以在退火温度反应而不失活的。除非少数耐热的很贵的RT酶。
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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