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- xuanya
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- XY-TE-0754
- 2025年11月21日
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- 询价记录
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- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
Cell Lysate RT-PCR Kit
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本产品是一种免 RNA 提取的 RT-PCR 试剂盒，它使用精心优化的细胞裂解 液直接裂解培养细胞，然后直接在细胞裂解液中进行 RT，再用 cDNA 进行 PCR 或荧光定量 PCR。本产品特点如下：
1. 免 RNA 提取，从细胞裂解到 RT-PCR 或实时定量 RT-PCR 结果只需三个步 骤，省略了整个 RNA 提取过程。
2. 灵敏度不低于常规方法（先提总 RNA 再进行 RT-PCR），不但可以检测到 低拷贝的 RNA，还可用于检测 miRNA。
3. 整合了去除基因组 DNA 的步骤，只检测 RNA，无需担心基因组 DNA 的污 染。
4. 每次只需要 10-100000 个培养细胞或含相应细胞数的痕量组织（如 LCM 样品），验证过的细胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于 U937 细胞系。
5. 两步法 RT-PCR，后续使用灵活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可 用于基于 SYBR 的荧光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan）， 非常灵活。
6. 即适用于少量样品，也适用于平行处理大量样品及高通量筛查。
7. 本产品足够用于 50 次 20µL 体系的 RT 和 600 次 30µL 体系（或约 200 次 100µL 体系）的 PCR。
免RNA提取RT-PCR试剂盒运输及保存：
低温运输，-20℃保存，有效期两年。
自备试剂：RT 引物、PCR 引物对
免RNA提取RT-PCR试剂盒使用方法
注意：无 RNase 的环境和使用无 RNase 污染的试剂是本实验成功的关键。 强烈建议使用天恩泽的固相 RNase 清除剂去除工作台面的 RNase，用气相 RNase 去除空气中的 RNase。实验前需要将 95%乙醇放-70℃预冷，最好用空 枪头盒盛乙醇。
免RNA提取RT-PCR试剂盒一、细胞培养、裂解
1. 按常规方法培养细胞、胰酶消化并计数。
2. 转移 1×10E5 个细胞到离心管中，400×g 离心 4 分钟。
3. 吸弃上清（即培养基），保留细胞沉淀。
4. 用 0.5 mL 溶液 A 重悬细胞，并将细胞浓度调整到 2×10E5 细胞/mL。
5. 转移 10 µL 的悬浮细胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此 时细胞终浓度为 10E5 细胞/mL。
6. 迅速将离心管插入浮子中，放入-70℃预冷的、95%乙醇中 1-3 分钟。10 µL 枪头盒一般能让 0.2 mL 的 PCR 管一半没入到乙醇中。
7. 在室温的水浴锅中快速解冻细胞，涡旋 10 秒后短暂离心数秒，将管中液体 （细胞裂解液）转移到新的离心管中，放冰上待用。
免RNA提取RT-PCR试剂盒二、RT（逆转录）反应合成 cDNA 8. 按下表设置 RT 反应体系（以 20 µL 体系为例）:
9.42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
10. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作 为 PCR 模板使用，不需要纯化。也可以放置在-20℃长期保存。
三、PCR 方案一（RT 产物全部用于 PCR）
11.在上步的 RT 反应管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 体系为例）：
12.直接进入第 14 步。
免RNA提取RT-PCR试剂盒四、PCR 方案二（部分 RT 产物用于 PCR）
13.按下表设置 PCR 反应体系（以 30 µL 体系为例）：
注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。
14. PCR 反应参数(需要根据模板和引物 Tm 值决定，下面的参数只做参考)：
15.取 5-10 µL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出 扩增产物的大小。
注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。
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文献和实验获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径 1．RNA的提取 RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取和RT-PCR 在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。 真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译
,但要防止丢失RNA沉淀,静置以挥发乙醇.9、DEPC水30ul 溶解RNA,并在55℃条件下孵育10分钟助溶。二、紫外光检测：紫外光检测260nm与280nm吸光度，计算RNA浓度与A260/280（factor:select—RNA---ref.）,比值最好大于1.65(不过我有几次小于此值也出来了,大于此值也有没批出来的时候)三、RT-PCR(试剂盒为MBI)制备cDNA第一条链：（promega）1、 于PCR管中加入：总RNA 0.5-5ug(5ul)oligo(dT)18 1ul
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