HBG2远端启动子中的单碱基治疗性插入重新激活γ-珠蛋白表达

背景：重新激活发育过程中被沉默的γ-珠蛋白基因（HBG1/2）已被证明是改善β-血红蛋白病症状的一种有前景的治疗策略。目前，治疗靶点的焦点主要放在主要的胎儿血红蛋白抑制因子，如BCL11A和ZBTB7A及其在HBG近端启动子上的结合位点。然而，远端HBG启动子在调节基因表达中的作用仍有待探索。方法：我们使用CRISPR/Cas9系统编辑远端HBG启动子。通过体外和体内实验，以及移植的NCG-Kit-V831M小鼠，进行功能验证和机制研究。结果：我们发现在HBG2转录起始位点上游−1368和−1369 bp之间插入一个核苷酸A（insA），导致HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白表达显著增加。我们还观察到，在来自健康个体和β-地中海贫血患者的CD34+红系祖细胞中引入insA突变后，γ-珠蛋白表达升高。同样，移植的NCG-Kit-V831M小鼠也显示出γ-珠蛋白表达增加。重要的是，insA既没有脱靶效应，也不影响红系细胞的成熟。此外，我们发现insA突变为转录激活因子FOXO3创造了一个结合位点，FOXO3被AMPK激活。另外，引入insA通过减少DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）的富集，特异性地去甲基化了HBG启动子上的−162 CpG位点。同时，它激活了HBG远端和近端启动子中的组蛋白修饰和RNA聚合酶II（Pol II），并可能抑制BCL11A和ZBTB7A分别与HBG启动子上−115和−200位点的结合。此外，insA与−115或-200编辑靶点的组合导致重新激活γ-珠蛋白基因表达的效果放大。结论：总之，我们使用来自健康供体或β-地中海贫血患者的CD34+ HSPC细胞以及随后移植的小鼠，提供了支持insA在调节γ-珠蛋白表达中作用的临床前数据。我们的研究表明，引入insA突变可显著提高胎儿珠蛋白水平，并为β-血红蛋白病揭示了新的安全治疗靶点或策略。