m7G修饰富集分析
探究circRNA中是否存在m7G修饰及其序列偏好
对HCT116细胞进行m7G-RIP测序，鉴定circRNA、lncRNA和mRNA上的m7G修饰峰，并进行基序分析。
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靶向富含m7G修饰的circKDM1A阻止结直肠癌进展
Targeting m7G-enriched circKDM1A prevents colorectal cancer progression
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭、凋亡）、体内动物模型（肺转移）、临床样本分析（组织芯片、IHC、FISH）及机制验证（RIP、RNA pull-down、Western blot、AKT通路抑制）。
主要模型
HCT116细胞 SW480细胞 BALB/c裸鼠肺转移模型 CRC患者组织
重点核对
METTL1表达水平及活性位点突变对circKDM1A m7G修饰的影响 circKDM1A GG基序突变对m7G修饰及稳定性的影响 circKDM1A与miR-147b-3p的相互作用 circKDM1A对PDK1及AKT通路活化的影响 动物模型中circKDM1A对肺转移的影响
摘要
大量circRNA已被报道在结直肠癌（CRC）中发挥重要作用，而癌症中circRNA异常表达的原因仍不清楚。在这里，我们发现m7G RNA修饰在一些circRNA中富集，这些circRNA中的m7G修饰由METTL1催化，GG基序是circRNA中m7G修饰的主要位点偏好。我们进一步证实METTL1在CRC中发挥促癌作用。然后我们筛选了一个高表达的circRNA，称为circKDM1A，并发现METTL1通过m7G修饰阻止circKDM1A的降解。circKDM1A进一步被证实在体内和体外促进CRC的增殖、侵袭和迁移。其促癌能力在m7G位点突变后减弱。circKDM1A被证实通过上调PDK1激活AKT通路，从而促进CRC进展。这些结果表明m7G修饰的circRNA通过激活AKT通路促进CRC进展。我们的研究揭示了METTL1介导的m7G修饰在调节circRNA稳定性和癌症进展中的重要生理功能和机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌中circRNA是否含有m7G修饰，以及m7G修饰如何影响circRNA的稳定性和功能，从而促进肿瘤进展。
- 核心机制
- METTL1通过GG基序依赖的m7G修饰增强circKDM1A的稳定性；circKDM1A通过与miR-147b-3p结合（海绵作用）上调PDK1，进而激活AKT通路，促进结直肠癌进展。
- 主要证据
- m7G-RIP-seq和MeRIP-qPCR显示circKDM1A富含m7G修饰且依赖METTL1；Actinomycin D实验证明GG突变降低circKDM1A稳定性；细胞实验（CCK8、Edu、Transwell、流式）证明circKDM1A促增殖、迁移、侵袭；体内实验显示circKDM1A促进肺转移；Western blot证明circKDM1A通过上调PDK1激活AKT通路，MK2206抑制AKT可逆转其效应。
- 研究意义
- 首次揭示METTL1介导的m7G修饰通过调控circRNA代谢促进结直肠癌进展，为结直肠癌靶向治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
METTL1功能验证
验证METTL1在结直肠癌中的表达及功能作用
通过TCGA、临床样本分析METTL1表达，构建METTL1敲低和过表达细胞系，检测细胞增殖、迁移、侵袭及体内转移。
circKDM1A鉴定与功能验证
筛选并验证METTL1调控的m7G修饰circRNA，检测其对CRC细胞功能的影响
结合siMETTL1-seq和m7G-RIP-seq筛选差异circRNA，验证circKDM1A环状结构；通过siRNA敲低circKDM1A进行细胞功能实验（克隆形成、Edu、流式凋亡、Transwell）。
m7G修饰对circKDM1A稳定性的影响
验证METTL1介导的m7G修饰（GG基序）对circKDM1A稳定性的调节作用
构建GG突变circKDM1A质粒，检测m7G-RIP富集、RNA稳定性（Actinomycin D处理）、METTL1敲低或过表达对circKDM1A表达的影响。
机制验证：circKDM1A-miR-147b-3p-PDK1-AKT通路
阐明circKDM1A促进CRC进展的分子机制
检测circKDM1A细胞定位及与AGO2结合，进行RNA pull-down和RIP验证与miR-147b-3p相互作用；Western blot检测AKT通路蛋白变化；使用siPDK1或MK2206进行拯救实验。
体内功能验证和临床相关性分析
验证m7G修饰对circKDM1A促癌作用的影响以及临床相关性
构建circKDM1A野生型和GG突变稳定细胞系，尾静脉注射裸鼠，观察肺转移；在临床样本中检测METTL1、circKDM1A、miR-147b-3p、PDK1、p-AKT的表达相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Clark Bioscience | -- | |
| m7G-RIP测序 | RNase R | Epicentre Biotechnologies | -- |
| GenSeq m7G-IP试剂盒 | GenSeq Inc. | -- | |
| NEBNext® Ultra II 链特异性RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| siMETTL1测序 | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Agilent扫描仪G5761A | Agilent Technologies | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1载体 | Hanbio Biotechnology | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取与qRT-PCR | RNAiso Plus试剂 | Takara | -- |
| NanoDrop One紫外可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| All-in-One™第一链cDNA合成试剂盒 | Uelandy | -- | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液试剂盒 | Yeasen | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| AKT抗体 | Abcam | ab179463 | |
| 磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| PDK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3062 | |
| E-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 3195 | |
| Palladin抗体 | Proteintech | 10853-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| FISH | Cy3标记的circKDM1A探针 | GenePharma | -- |
| FISH试剂盒 | RiboBio | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫组化 | METTL1一抗 | Proteintech | 14994-1-AP |
| 磷酸化AKT一抗 | Servicebio | GB150002-100 | |
| DAB显色系统 | Zsgb-bio | PV-6000D | |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| RNA pull-down | BersinBio™ RNA pull-down试剂盒 | BersinBio | Bes5102 |
| RNA清洁与浓缩试剂盒-25 | ZYMO Research | R1017 | |
| RIP | 蛋白A/G磁珠 | -- | -- |
| IgG抗体 | Millipore | -- | |
| Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| m7G-circRNA meRIP | m7G抗体 | MBL | RN017M |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 吉姆萨染液 | Solarbio | -- | |
| Edu实验 | Cell-Light™ Edu Apollo体外检测试剂盒 | RiboBio | C10310-1 |
| CCK8实验 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | Uelandy | C6031 |
| 动物实验 | LipoFilter转染试剂 | Hanbio Biotechnology | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 新霉素G418 | -- | -- | |
| D-荧光素 | Yeasen | -- | |
| IVIS Illumina成像系统 | Caliper Life Sciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HCT116和SW480细胞培养于高糖DMEM，293T细胞培养于RPMI 1640，均添加10%胎牛血清，37℃、5% CO2；细胞来源需验证。 阅读提示：Methods: Patient tissue specimens and cell lines |
| m7G-RIP测序 | 使用m7G抗体（RN017M）进行免疫沉淀，RNase R消化线性RNA，测序平台为Illumina NovaSeq；生物信息分析流程（STAR, DCC, Hisat2等）需复现。 阅读提示：Methods: M7G-RIP sequencing |
| 质粒构建与转染 | pcDNA3.1载体，GG/GT突变位点，METTL1催化失活突变（EIR→AAA）；使用Lipofectamine 3000转染；siRNA靶向circKDM1A和METTL1的backsplice junction位点。 阅读提示：Methods: SiRNA and plasmid construction |
| Western blot | 抗体信息（AKT ab179463, p-AKT 4060, PDK1 3062等），RIPA裂解，BCA定量，SDS-PAGE电泳，PVDF膜转印，5%脱脂奶粉封闭。 阅读提示：Methods: Western blot analysis |
| RNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（100 ng/mL），处理时间点（0,8,16,24小时），qRT-PCR检测circKDM1A表达变化。 阅读提示：Methods: RNA Stability Assay |
| Transwell实验 | 细胞数量（5×10^5），8 μm孔径膜，Matrigel包被（侵袭实验），培养时间（36-72小时）。 阅读提示：Methods: Transwell assay |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠（4周龄），尾静脉注射稳定细胞（2×10^6），荧光或生物发光成像检测，肺转移结节计数。 阅读提示：Methods: Animal models |
| 统计分析 | GraphPad Prism 10.0，数据表示为均值±SD，Student's t-test，Pearson相关，log-rank检验，p<0.05为显著。 阅读提示：Methods: Statistical analysis |