全基因组CRISPR筛选
鉴定调控hiPSC向心肌细胞分化的基因
在hiPSC中导入Brunello文库，进行CRISPR敲除，分化后比较sgRNA富集/耗竭，筛选调控分化的基因。
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全基因组CRISPR筛选鉴定BRD4为心肌细胞分化的调节因子
A genome-wide CRISPR screen identifies BRD4 as a regulator of cardiomyocyte differentiation
实验完整度
高包含全基因组CRISPR筛选、体外分化模型（mESC和hiPSC）、体内条件性敲除小鼠模型、单细胞转录组学及CUT&RUN等多层级实验验证，明确涵盖功能与机制验证。
主要模型
人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化模型 小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化模型 Isl1Cre/+;Brd4flox/flox小鼠模型 Mef2c-AHF-Cre;Brd4flox/flox小鼠模型
重点核对
CRISPR筛选使用Brunello文库，感染率30%，puromycin筛选6天 JQ1处理浓度：0, 25, 100, 250 nM（CPC阶段） Mef2c-AHF-Cre;Brd4flox/flox胚胎在E9.5进行scRNA-seq，n=2/基因型 体内BRD4缺失导致RV厚度减少（E12.5: 44.7μm vs 20.6μm） Wnt抑制剂XAV939（2.5μM）和IWP4（5μM低剂量，10μM高剂量）处理
摘要
人类诱导多能干细胞（hiPSC）向心肌细胞（CM）的分化重塑了研究心脏发育和疾病的方法。在本研究中，我们在hiPSC向CM分化系统中进行了全基因组CRISPR筛选，并发现BRD4（bromodomain和extraterminal（BET）家族的成员）调节CM分化。在小鼠胚胎干细胞（mESC）来源或hiPSC来源的心脏祖细胞（CPCs）中，BET蛋白的化学抑制导致CM分化减少，并持续表达祖细胞标记。在体内，第二生心区（SHF）CPCs中BRD4的缺失导致胚胎期或出生后早期致死，突变体表现为心肌发育不全和CPCs增加。单细胞转录组学鉴定出SHF CPCs的一个亚群对BRD4缺失敏感，并与CM谱系特异性基因程序的减弱相关。这些结果突显了BRD4在发育过程中对CM命运决定此前未被认识的作用，以及SHF CPCs中BRD4需求的异质性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRD4是否以及如何调控心肌细胞分化？
- 核心机制
- BRD4作为转录共激活因子，在心脏祖细胞中调控心肌分化基因程序；其缺失导致Wnt信号过度激活，维持祖细胞未分化状态，抑制心肌细胞分化。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定BRD4；体外BET抑制或BRD4缺失减少心肌细胞分化；体内SHF CPCs中BRD4缺失导致心肌发育不全和CPCs增加；单细胞转录组学显示MSX1/2+祖细胞亚群对BRD4缺失敏感；CUT&RUN显示BRD4富集于Wnt信号相关基因的活性染色质区域。
- 研究意义
- 揭示了BRD4在心脏发育中的新作用，为先天性心脏病的分子机制提供了见解，并可能为改善hiPSC向心肌细胞分化效率提供靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外药物抑制和基因敲除验证
验证BRD4在心肌细胞分化中的作用
在mESC或hiPSC分化至CPC阶段时，使用BET抑制剂JQ1或MZ3，或在mESC中通过TAM诱导BRD4敲除，检测心肌细胞分化标志物。
体内条件性敲除小鼠模型
验证BRD4在心脏祖细胞分化中的必要性
使用Isl1-Cre和Mef2c-AHF-Cre小鼠与Brd4flox/flox杂交，观察胚胎心脏形态和心肌厚度。
转录组分析
探究BRD4缺失后的分子变化
对mESC分化和E9.5小鼠SHF组织进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路。
单细胞RNA测序
鉴定对BRD4缺失敏感的细胞亚群
对Mef2c-AHF-Cre;Brd4flox/flox和对照E9.5胚胎的心脏区域进行scRNA-seq，分析细胞异质性。
CUT&RUN分析
绘制BRD4在CPC中的全基因组结合图谱
在hiPSC来源的CPC中进行BRD4/FLAG、H3K4Me3、H3K27Me3的CUT&RUN，结合H3K27Ac ChIP-seq数据，分析BRD4结合区域。
Wnt通路功能验证
验证Wnt信号上调是否参与BRD4缺失的表型
在BRD4敲除或抑制的细胞中，添加Wnt抑制剂（XAV939或IWP4），检测心肌分化指标是否部分恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | Brunello慢病毒文库 | Addgene | 73178 |
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | -- | -- |
| 心肌分化 | CHIR 99021 | Cayman Chemicals | -- |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| JQ1 | gift from Jun Qi | -- | |
| MZ3 | -- | -- | |
| XAV939 | Cayman Chemical | 13596 | |
| B-27添加剂（不含胰岛素） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 激活素A | R&D Systems | -- | |
| 骨形态发生蛋白4 | R&D Systems | -- | |
| 血管内皮生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 成纤维细胞生长因子10 | R&D Systems | -- | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| GlutaMAX添加剂 | Invitrogen | 35050-061 | |
| StemPro-34无血清培养基 | Invitrogen | 10639-011 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RPMI/B27（不含胰岛素）培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 乳酸 | Sigma Aldrich | L7900 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | SH3007003 |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| ESGRO白血病抑制因子 | Sigma-Aldrich | ESG1107 | |
| 聚甲基丙烯酸羟乙酯 | -- | -- | |
| Geltrex基质胶 | Life Technologies | -- | |
| 基质胶 | Corning | 354230 | |
| Accutase消化液 | STEMCELL Technologies | 07920 | |
| CRISPR筛选 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 病毒生产 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985062 |
| 脂质体转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| Plus转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11514015 | |
| 蛋白质印迹 | 抗BRD4抗体 | Bethyl | 00396 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| 抗兔HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| ECLPrime化学发光底物 | GE Life Sciences | RPN2232 | |
| SuperSignal West Femto化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34094 | |
| 流式细胞术 | 抗心肌肌钙蛋白T抗体 | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P |
| BV421偶联抗TNNT2抗体 | BD Biosciences | 565618 | |
| 同型对照抗体 | BD Biosciences | 562439 | |
| 组织学 | 抗Islet1抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 39.4D5 |
| 抗Tnnt2抗体 | Thermo Fisher Scientific | MS-295P1 | |
| 抗Axin2抗体 | Abcam | ab32197 | |
| 抗Msx1+2抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G1 | |
| 抗活化的caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664L | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab6673 | |
| 抗RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| RNAscope原位杂交 | Advanced Cell Diagnostics | -- | |
| CUT&RUN | CUT&RUN试剂盒 | EpiCypher | 14-1048 |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| DNA提取 | QuickExtract DNA提取液 | Epicentre | QE09050 |
| 细胞培养 | TrypLE消化酶 | Thermo Fisher Scientific | 12563029 |
| 测序 | 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | SYBR Green荧光染料 | Applied Biosystems | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 感染复数（MOI）约30%，细胞数量（12.5百万/T225瓶），筛选时间（6天），sgRNA覆盖度 阅读提示：Methods: CRISPR screening, DNA preparation and analysis |
| 体外心肌分化（mESC） | 分化起始细胞浓度（5×10^4/mL），EB形成时间（2天），悬浮培养时间（2天），贴壁后培养基成分，BRD4敲除诱导时间（第5天）和TAM浓度（1μg/mL） 阅读提示：Methods: CM differentiation |
| 体外心肌分化（hiPSC） | 基质胶包被，Activin A (100 ng/mL, 18小时)，BMP-4 (5 ng/mL), CHIR99021 (1 nM), XAV939 (1 nM), 处理时间点（第0天、第2天、第4天等），JQ1或MZ3添加时间（第6天） 阅读提示：Methods: CM differentiation |
| 体内小鼠模型 | 小鼠品系背景（CD1;C57BL/6;129S1/SvImJ），胚胎发育时间点（E9.5-E14.5），基因型判定方法，Cre品系（Isl1-Cre, Mef2c-AHF-Cre），Brd4flox等位基因 阅读提示：Methods: Animals |
| 单细胞RNA-seq | 组织解剖区域（心脏和周围间充质），解离时间（10分钟），细胞过滤参数（UMI 5000-75000, 基因数>7500, 线粒体比例<15%），测序深度（>50,000 reads/cell） 阅读提示：Methods: Embryo dissection and single-cell library generation/sequencing |
| CUT&RUN | 细胞类型（hiPSC来源CPC），抗体（抗FLAG, 抗BRD4, 抗H3K4Me3, 抗H3K27Me3），重复数，数据分析参数（FDR 0.01） 阅读提示：Methods: CUT&RUN chromatin profiling |
| Wnt抑制验证 | XAV939浓度（正常2.5μM或加倍5μM），IWP4浓度（5μM或10μM），处理时间与BRD4抑制同时，检测时间点 阅读提示：Methods: CM differentiation; Extended Data Fig. 6 |